第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。
3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。

第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度，过夜。  
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；
3）42度， 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。
3：取白斑，划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。
针头挑白斑划2道于板上相应区域内。
37度，孵箱过夜。
4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。

这一部分的细节：
1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；
2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。

以上是我实验的全部过程，终于写完了和大家分享，希望对大家有帮助。如有疑问，敬请提出，以便交流。并请不吝斧正

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