DEPC处理的三蒸水8μl
质粒DNA模板0.05μg／μl 1μl
10xNTP地高辛标记混合物 1x 2μl
0.1MDTT溶液 10mM 2μl
5x转录缓冲液1x 4μl
RNAse抑制剂 2U／μl1μl
RNA聚合酶 2U/μl 2μl
反应体系总体积 20μl
5．加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37℃孵育2h。
6．加入2μl无RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37℃孵育15min降解模板DNA。
7．加入0.2MEDTA(pH8.0)溶液2μl终止反应。
8．加入2.5μl的4MLicl和7.5μl冷的无水乙醇，混匀，-20℃放置2h。
9．12000g下离以15min，弃上清，小心地用50μl冷的70％乙醇洗涤沉淀。
10．室温下稍干燥，溶于100μ1DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20℃下保持备用。
三、原位杂交
3.1冰冻切片与杂交前预处理
1．将子宫样品从-80℃取出，用OCT包埋，在-23℃(切片机腔体温度)平衡至少30min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg／m1)的玻片上(玻片预先经180℃干烤6小时)，保存于-70℃冰柜备用。
2．冰冻切片经室温干燥10min后，在4％的多聚甲醛-PBS(pH7.4)固定l0min。
3．活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1％DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5min。
4．在0.2M的盐酸作用中作用10min后，重复步骤4)。
5．在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg／m1)，37℃孵育15min，重复步骤4)。
6．经0.1MTEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1MTEA(乙酸酐／三乙醇胺，pH8.0)中乙酰化10min。(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)
7．5xSSC中平衡15min。
3.2杂交
8．在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100μl／玻片)，置于放有湿盒液(50％甲酰胺v／v；0.3MNaCl；1MmEDTA；10mMTris-Cl，pH8.O)的湿盒中，55～58℃下的烘箱中预杂交2h。
9．甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng／μl)经70℃变性1O分钟，置冰上1min，玻片上滴加预杂交液(约60μl／玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58℃下杂交18-30h。
3.3杂交后处理
10．取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52℃预热的5×SSC洗30min。
11．在无DNA的RNA酶A(20μg／ml)溶液中37℃下孵育30min。
12．分别依次用52℃预热的2XSSC，1XSSC和O.1XSSC洗2次，每次30min。
3.4杂交信号检测
13．在缓冲液A(0.1MTris-HC1pH7.5，0.15MNaC1)中平衡5min。
14．在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1：500～1:2000稀释于含0.5％阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h。
15．用缓冲液A洗2次，每次15min。
16．在缓冲液B(0.1MTris-HCl；0.1MNaCl；0.05MMgCl_2，pH9.5)中平衡5min。
17．硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.5μ1NBT和3.5μ1BCIP。在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。
18．充分显色后，用EDTA(1mMEDTA，pH8.0)洗15min终止反应。
19．在95％乙醇中洗lh以除去非特异的背景。
20．用蒸馏水洗15min除去可能存在的结晶体。
21．脱水、透明，用中性树胶封片。
22．充分干燥后在显微镜下观察、照相。
