使用比较CT法的优点就是可以不需要标准曲线。也可以排除在创造标准曲线时因为稀释误差而引起得副作用。只要目的基因及参照物有着类似得动态范围，则比较CT值法是最有效的方法。我们希望校正物比目的基因有较高得表达水平（较低的CT值），定量得计算就是获得目的基因和校正物间的CT值差别（⊿Ct）开始得。
⊿Ct＝Ct(目的基因)－Ct（校正物）
对每一个要被定量的样品，这个值都被计算（如果目的基因值比校正物值高，则是正值，而如果是个负值也是可以得）应该选择一个样品作为参照（基线），这样其他样品都与其相比较。相比较的⊿⊿Ct包括了每个样品间⊿Ct值的差异，及与基线相比较的差值。如果基线代表了最小的表达水平，则⊿⊿Ct应该是负值，因为基线样品的⊿Ct是最大的，因为它有最大的CT值。如果有些样品的表达水平是升高，而另一些下降，则⊿⊿Ct是个负值和正值得混合。定量的最后一步就是将这些值转换成绝对量，相对表达量的公式是2-⊿⊿Ct
h)使用双标记探针进行多重反应
我们可以在ROTOR-GENE上进行多重反应，因为它可以检测多种荧光。一个管内最多可以检 测4种荧光，在ROTOR-GENE上可是使用FAM,JOE ,ROX CY5(想要进一步了解荧光素，可以去 看FAQ)
最常用到的多重扩增反应是对基因表达的定量。一个标记FAM的探针来检测看家基因，而用 别的的荧光素标记来检测同一个反应管中的另外1，2，甚至3个不同基因，在一个管中进行 四重反应，不仅可以降低反应成本，同时也可以降低对将样品分装到2至4个管中时加样准性的依赖。
为了进行一个多重反应，要确保一个目的基因的扩增不会影响另一个。一个目的基因的主
导性会降低另一个相对量少的目的基因得扩增效率。这可能会导致不正确的结果，甚至会
完全抑制了对相对量少的目的基因的检测。
为了决定引物限制浓度，应该使用终浓度20Nm到100nM之间进行几个反应，这样做得目的在于不影响CT值的前提下，尽量降低背景之上荧光值的增长。
使用双标记探针的扩增反应的Mg离子浓度要比一般反应中的高，因为Tag酶得5’-3’外切 酶的作用需要较高得Mg离子浓度。由于双标记探针需要5’-3’酶活性，必须要高Mg离子浓 度（最少3.5nM,一般5nM）
i) 使用双标记探针进行突变检测
为了检测突变体，要设计两种不同颜色的探针。一个探针设计来检测野生型，可以标记FA
M，同时设计另一个标记JOE的探针来检测突变体。通常两个探针的差别只有1个bp，由于两 个探针相差极小，因此推荐使用严格的反应条件。
选择“analyse”和”Allelic discrimination”来分析数据，两个通道的结果会呈现在一
个屏幕中，没有标记物的曲线是CH1结果，有循环数的是CH2，最多可以有四个探针(两个突 变体)可以被分析，在编辑好基因型名称，将域值调整到0以上后，结果就会在图下方的表 格中显示出来。
j) RT-扩增
有一些扩增反应在ROTOT-GENE上进行反应之前，有一个RT步骤，SG和双标记探针都可以完 成。最近有一篇综述“Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays”,可以去 johurnals.endocrinology.org/jme/025/jme0250169.htm
k) 看家基因
由于DAN/RNA量不同，基因表达的定量分析都要与一个初始参照基因想比较。对于RNA的量 ，由于组织，细胞数目，试验步骤，或RNA抽提效率的不同，会有很大的波动，下面一篇文 章就很好的告诉你，你的看家基因是否适合你的需要。
Schmittgen TD， Zakrajsek BA . Effect of experiment treatment an housekeeping
gene expression validation by real-time quantitative RT-PCR.J Biochem Biophys
Methods 2000NOV 20:46（1－2）：69－81
这里还有一些经常被使用的看家基因：beta-actin, GAPDH， cyclophilin,18sr RNA ,ph
osphoglyserokinase,beta-microglobulin,beta-glucronidase,hypoxanthine ribosyl t
ransferase,transferring receptor 及另外一些。要注意看家基因可以被反应调节所影响 ，在设计定量表达研究时，保证初始对照基因的质量是必须得。
l) 一些关于储存的建议
双标记探针可以保存在－80℃至少一年，在使用前将干粉稀释成已知浓度的储存液， 然后 分装在－20℃度保存。取出所需要的微量管中的探针溶解，放在冰上，直到使用时再打开 。如果每天都使用，则探针储存液应该用HPLC水稀释到一个恰当的浓度，TE 溶液，10m M Tris(ph7.5).如果想长期保存探针，可以在稀释液中加入0,01%Tween 20和0.01%Gelati n。这样保存的探针可以一年或更长时间内不会降解。为了确保光学活性和最大反应果， 荧光探针都要避光保存。 （生物秀实验频道 www.bbioo.com）
