d循环参数
当引物和探针按照上述原则设计好后，循环的参数也就确定了，当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定)，反应要经过95℃，15－20秒，60℃60秒，对于一些模板，45秒也足够了。数据在退火时检测。
e)怎么优化探针和引物的浓度
对于双探针反应，通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果，，能获得最低的CT值，以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。
引物浓度应该在50nM -900nM 范围内进行优化，下面的表格显示了前后引物9种可能浓度 组合的结果
探针浓度应该在50－250nM范围内优化
前引物
后引物 50 300 900
50 50/50 300/50 900/50
300 50/300 300/300 900/300
900 50/900 300/900 900/900
探针的浓度应该从（50，100，250nM）与9种引物浓度相组合，也既是27种可能根据前面所述的循环参数，在Rotor-Gene上进行试验，选择最小CT值和最高反应扩增的曲线做后续试验。
g) 进一步的提示
通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM，绝大多数反应都可以在这个浓度下进行，但为了寻找最佳的浓度，还是应该依照上述的步骤。
由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序，因此使用三种退火温度（58，60，62℃）对优化是很有用的。
引物的浓度也会影响溶解温度，高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。
可以从以下网站获得探针，引物设计软件。
www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3
Primer3是个非常有用的软件，但他不能避免3‘端的G，所以我们将3’端的G去除，并观察探针的退火温度是否比引物高8－10度。
f)定量数据的分析
分析定量数据主要有两种基本的方法
i)绝对定量
ii)相对定量
研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据
h) 绝对定量
绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的
DNA样品，关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论，理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得，然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因，并与未知样
品比较。要注意得是，绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。
在Rotro-Gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的，R值，反应 效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整， （或重复相同的标准品），这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个 标准曲线来说，一个单独的标准品就已经足够了。我们也可以在不同的通道甚至一个通道 内绘制多条标准曲线。最后提到的功能主要是为了那些想用SYBR-Green分析两个基因的使 用者。
ii)相对定量
相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率。没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法（⊿⊿Ct）这种方法可以彻底不需要标准曲线，通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平（norm alizer），从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功，目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看⊿Ct（相同的起始模板浓度，两个扩增子的两个CT值的差异）随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同，则the plot of log input amount versus ⊿Ct 将是一条水平线（斜率< 0.01）。这意味着在初始模板浓度范围内，两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致，则应该用标准曲线来对基因表达进行定量，或优化反应使得获得一个类似的效率。动态范围应该有下面两点决定（1）目的基因使用最小和最大的浓度其结果都是准确的（2）两个基因的最小和最大的定量比值都是准确的）
将目的基因和内参照在不同的管中扩增使用标准曲线法是最少需要优化得。
