e) 使引物二聚体消失
这一部分描述了即使出现引物二聚体，如何在Roter-Gene上获得好的数据。虽然以上 描述的优化步骤都应该履行， Roter-Gene上的软件的一个功能可以让我们在原始数据屏幕 和定量屏幕上看到减少的引物二聚体数量。一旦感兴趣基因和引物二聚体的溶解温度确定来，可以引入第四步—temperature profile（温度描绘）中的一个功能。通过按压edit profile中的“+”，在profile中简单加一个额外的温度步骤，在引物二聚体溶解温度以上，扩增子溶解温度以下的温度点获得数据。这个额外步骤应维持15秒。由于温度比较高，增加非特异产物不太可能。由于在2个温度都获得数据，有可能确定结果之间的差别。
循环A和循环B分别在72度和84度获得数据。红色，桔红色和棕色曲线分别代表6种不的DNA浓度，蓝色样品代表合适的NTCs。在循环A中看不到NTC，循环B中看不到非特异扩 增产物。溶解曲线显示DNA产物在右侧，NTCs在左侧。
f) SG反应中的小窍门和经常会问到的问题
1）以上的优化步骤，有时候反应还不能正常进行。这主要源于DNA的纯度，可能是PCR抑制物使扩增反应不能进行。一个检测反应抑制物的可能办法是将反应混合物与已知模板和适当引物混合，如果不能反应则可能是抑制剂的原因。
2） 如果SG反应不能正常进行，有报道说0.025%Tween-20对SG反应有利。
3） 通常SG稀释在水或TE缓冲液中。将SG稀释在DMSO中有可能解决一些研究者在贮存稀释后的SG时遇到的问题。
4a) 关于制备个人用10*SG Master
混合：
100mM Tris pH 8.3
500mM KCl
0.1% Tween-20
8%Glycerol
10*SG (依赖优化的结果)
4b) 下列的Master Mix由Morrison et al.报道，Biotechniques(1998)24:954
50mM Tris pH 8.3
3mM MgCl2
0.5 mg/ml BSA
0.2mM each dNTP
0.33*SG(从分子探针)（或者你的优化浓度）
50Units/ml HotStarTaq-polymerase(Qiagen)
50nM 到 300nM/每个引物
总共20微升的反应体系含一微升模板
5）为了在SG反应后作溶解曲线，引入与溶解曲线起始温度点相同的保温步骤（大约60秒），这样可以确保溶解温度起始于一个确定的温度。
6）溶解曲线分析可以重复。可以在相当一段时间内重新作溶解曲线，甚至到第二天也可以。
7）关于可以用SG检测的引物对的列表，请查询 www.realtimeprimers.org
8) 进行SG分析的典型程序是什么？
变性：检查反应所用的酶（2min,5min,10min或15min）
循环：95度/20秒，退火温度/20秒，72度/20秒
保温：72度/60秒
溶解：72-99度，on Melt A
要获得更多的细节请参考3.1.4
