3．SG, 双标记探针和FRET探针的优化
3．1 SYBR-GREEN I (SG) 的优化：
为优化SG反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2, dNTP和Taq酶浓度等）。结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。
SG分析的优化主要包括以下4个因素：
a) SG 浓度
b) 引物浓度
c) MgCl2浓度
d) 温度和反应次数
a) SG浓度
为获得合适的SG浓度应该做一下不同稀释度的实验。就像上文描述的那样（章节2.1），SG的原则是嵌入dsDNA中，因此SG直接关系到扩增反应的情况。过高的SG浓度会抑制反应。 相反，SG浓度不够会导致没有足够的SG来标记扩增子。合适的SG浓度应该有一个折衷的考虑。
推荐的SG终浓度变动范围是1：5000到1：100000。 经常用到的浓度范围是1：10000到1：70000。
优化分析的目的是找到最适SG浓度，确保没有引物二聚体产生，同时获得最强的荧光信号增加和最低的Ct值。
b) 引物浓度
引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范围应该是50nM到 300nM，然而，也有例外的情况。应该在固定DNA模板量的情况下作一系列的稀释度，同时要在没有模板的对照组（NTC）作相同的稀释度。针对于具有DNA模板的给定反应的最适引物浓度应该得到低Ct值和荧光信号的高增长（5到50倍），同时没有DNA模板（NTC）的对 照体系具有低Ct值。发生在NTC中的扩增是由于形成引物二聚体和非特异扩增产物。
同时也应该做这两种反应的溶解曲线。对于有DNA模板的反应应该得到单一的峰，在较低的溶解温度也没有其他峰出现。在较低的溶解温度出现其他峰可能是反应中引物浓度 过高。引物的量应该适当减少。
推荐用HPLC纯化后的引物。虽然对扩增产物没有太大差别，但对于NTC可能有较大的差别。 用未纯化的引物得到的扩增曲线可能导致Ct值的较大差异。纯化后的引物相比于未纯信号。另一方面也有报道说纯化引物和未纯化引物没有差别，可能与个别反应有关。
C) MgCl2 浓度
如上所述，SG反应能探测所有双链DNA。与可以容忍非特异扩增产物和引物二聚体的 双标记探针相比，能扩增出特异产物对于SG反应非常重要。这可以通过降低反应体系中的 MgCl2用量来获得。
获得最适MgCl2浓度的理想方法是做一系列的稀释度。检测到MgCl2的最低终浓度是1.5mM。做各种稀释度时应该包括NTC。
d)模板和反应次数
另一种优化反应的方法是选择扩增的最适温度。三个温度很重要：变性，退火和延伸
温度。对于变性温度我们推荐95度，延伸温度推荐用72度，根据所用酶的不同这个温度可 以变动，请参考生产者的推荐书。然而退火温度对反应有动态的影响，为了找到最适退火温度首先咨询生产引物的公司。除非例外，还需要额外的优化，这通过检测不同的退火温度来获得。一般而言，温度越高，反应特异性越好。
扩增反应所用的时间也很重要。最适于SG的延伸时间很难预测。基因组DNA相比于质粒 DNA需要较长的变性时间，较短的扩增子相比较长的扩增子较短的延伸时间已经足够。对于扩增子长度为200-300bp的给定CDNA扩增反应我们推荐以下的程序：
此程序只是一般的推荐，退火温度还需要调整。关于优化扩增反应在f部分有进一步的建议。
