2．2 双标记探针
双标记探针是一种短的寡核苷酸序列，5‘末端连接有荧光报告染料，3‘端连接有荧光淬灭分子。由于这种探针只有15-25bp长，报告基团和淬灭基团紧密接近，几乎探测不到荧光信号。在循环过程中，Taq DNA聚合酶对每个引物进行延伸。DNA聚合酶具有外切核酸酶活性，因此在延伸过程中会切除下游的探针。一旦探针被降解，报告染料就会与淬灭分子相分离。
a) 报告染料R发射的能量被淬灭分子Q所吸收和淬灭。
b) 聚合酶的外切核酸酶活性通过水解方式将报告染料与淬灭分子相分离导致了荧光信号的增加。
在每个扩增循环由于切开了探针因此实时设备探测到报告染料的增加。由于报告染料被切开，因此不能进行溶解曲线分析。双标记探针比内嵌染料有更高的特异性，这里有2个原因 。首先，双标记探针具有序列特异性，只结合到互补区。第二个原因是双标记探针对每扩增的一个拷贝只释放一个分子的荧光染料。由于双标记探针增加了特异性，这种探测方法很适合检测低拷贝数的模板。
2．3．FRET 探针
FRET 探针依靠荧光能量从一个荧光染料到另一个的传递。两个独立的特异寡核苷酸序列都标记上荧光基团。上游探针在3‘末端有一个供体基团，下游探针在5‘末有一受体基团。设计探针时他们在与目标序列结合时互相临近，使供体和受体荧光基团紧密接近。一旦探针杂交到模板上，从供体到受体荧光基团的能量传递产生了一个不同波长的荧光信号。供体荧光信号的减弱和受体荧光信号的加强都能分别监测到。因此，只有当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号。FRET 探针可以进行溶解曲线分析，对基因型分析，SNP检测和其他突变检测非常有用。
a) 扩增循环中，两个探针与靶DNA退火
b) 供体被外部光源激发通过能量传递导致发射荧光的产生。
2．4 分子信标
第四种检测方法是分子信标（MB）。这种探针的基本特征是有一个发夹结构，在此结构的一个末端有一个荧光染料报告基团，在另一个末端有一个淬灭分子。
这个发夹结构能使MB探针在不杂交时保持折叠状态，报告基团和淬灭分子处于极端接近的距离，几乎没有荧光信号发出。然而，当MB与模板杂交时，发夹结构被破坏，发色团不会被淬灭。在这个时间点，实时仪器能探测到荧光信号。用MB探针也可以进行溶解曲线分析。
a) 分子信标的发夹结构淬灭了荧光信号
b) 杂交后开始发射荧光信号
得益于实时探测技术的实际应用数量和应用类型影响深远。其中的一些益处包括有机体的鉴定，诊断性检测，基因表达研究，突变检测，SNP检测，基因型和微阵列结果确证等。每种不同的化学物质根据应用的不同会提供给用户不同的便利。应该注意的是，得益于实时测技术并建立在荧光化学物质基础上的还有其他检测核酸的等温扩增系统。
2．5 AmplifluorTM直直接基因系统
AmplifluorTM直直接基因系统基本特征是激发的荧光进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭。目标特异性AmplifluorTM直引物包含一个5‘内部互补序列，标记有荧光发色团（fluorescerin）和一个能量受体：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。发夹结构的3‘端序列是目标特异性引物区。未结合的AmplifluorTM直引物由于内部荧光发色团和淬灭分子的紧密接近，只有低的荧光信号。进一步的信息可查阅网站www.intergenco.com
在第一个循环中，Amplifluor引物1与特异CDNA的第一条链退火并被Taq酶延伸。在 第二个循环中 Amplifluor引物1延伸产物作为引物2（反义链引物）的模板。一旦引物2被 Taq酶延伸，Amplifluor发夹引物解折叠并产生荧光信号。随后的扩增循环中产生的荧光信号的增强与扩增产物量的增加成比例。
