目前real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。
扩增序列非特异性检测方法
DNA双链非特异性内嵌染料（SYBR GreenⅠ）能特异性地结合到双链DNA上，而不结合到单链DNA上，并且结合后的染料的发光强度会明显增加，没有结合的染料在溶液中只能发出很微弱的荧光。 
扩增序列特异性检测方法
扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，它又可分为直接法和间接法。
间接的方法就是利用水解探针的策略（TaqMan系统）。
间接法：TaqMan系统
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET），因此探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。
TaqMan探针工作原理示意图
直接法；分子信标
本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光 。
分子信标作用机理简图
定量方法
相对定量和绝对定量
相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。
标准曲线法的相对定量
比较Ct法的相对定量
标准曲线法的绝对定量
在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。
理想的标准品
在所有细胞中表达相同的拷贝数
所有细胞均有表达
中等拷贝数优势
目前无一统一标准
