一. 引物设计的基本原则
引物长度（primer length）
产物长度（product length）
序列Tm值 (melting temperature)
ΔG值(internal stability)
引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）
错误引发位点（false priming site）
引物及产物GC含量（composition）
1. 引物的长度
一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度
2. 引物3’端的序列
引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高
引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败
3. 引物的GC含量
一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
4. 引物所对应模板序列的Tm值
最好在72℃左右
5. ΔG值(自由能) ，
反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低
6. 引物二聚体及发夹结构的能量
一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行
二. Primer Premier 5.0引物设计软件简介
Primer Premier 5.0用途：
引物分析评价功能；
引物的自动搜索功能
Premier的主要功能：
