7＝引物浓度太低
建议解决方法：
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。
3.问题：RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。
可能原因：
1＝物和模板非特异性退火
建议解决方法：
在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。
试用允许高温cDNA合成的GSP。
2＝GSP设计较差
建议解决方法：
遵循用于扩增引物设计的同样原则
3＝RNA中沾染了基因组DNA
建议解决方法：
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
4.问题：PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。
可能原因：
1＝形成引物二聚体
建议解决方法：
设计在3'端没有互补序列的引物。
2＝引物和模板非特异性退火
建议解决方法：
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。
使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
3＝镁离子浓度太高
建议解决方法：
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
4＝因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法：
使用巢式PCR或递减PCR。
5＝沾染外源DNA
建议解决方法：
使用抗气雾剂的tip和UDG。
6＝因为二级结构导致引物结合位点无法接近
建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。
5.问题：PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误
可能原因：
1＝聚合酶忠实性低
建议解决方法：
使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。
2＝循环数太多
建议解决方法：
降低循环数。
3＝四种dNTP的浓度不同
建议解决方法：
制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
