取10μl PCR 扩增产物,在2 %或3 %琼脂糖凝胶上电泳,紫外灯下观察扩增产物。
2 结 果
分别扩增出大小为558bp 、708bp 和大小为116bp 的特异性片段, 与人CD137 胞膜外区、hIgG1Fc 片段和HBV DNA 聚合酶基因大小一致。见图1 、2 。
图1 降落PCR 扩增目的基因M:marker ,A :人CD137 胞膜外区,B : hIgG1Fc 片段,琼脂糖浓度为2 %
图2 降落PCR 检测HBV DNA 聚合酶基因突变M:marker ,1～6 :从6 位慢性HBV 感染者血清中抽提HBV DNA进行PCR 电泳条带,Pv :变异株对照质粒, Pw :野毒株对照质粒,C1 :第一轮PCR 空白对照,C2 :第二轮PCR 空白对照,琼脂糖浓度为3 %
3 讨 论
降落PCR 是一种设计多循环以使相连循环的退火温度越来越低,从而达到最佳扩增条件的方法[3 ] ,反应过程中起始退火温度高于Tm 值,随着循环的进行,退火温度逐渐降低到Tm 值,从而确保第一个引物- 模板杂交事件发生在最互补的反应物之间,退火温度最终低于Tm 值。退火温度的范围可跨越15 ℃,从高于Tm 5 ℃至低于Tm 10 ℃左右,条件允许的话,退火温度可以1 ℃或 015 ℃递降。尽管退火温度最终会降低到非特异性杂交的Tm 值,但此时目的扩增产物已开始几何扩增,在剩余循环中将超过任何非特异性产物的扩增量。降落PCR 是一种潜在的一步法找到最佳退火温度的方法[4 ] ,对于Tm 值相近的PCR 反应可在同一循环条件下进行,大大提高了工作效率[5 ] 。
在降落PCR 过程中需要采用热启动的方法[6 ] ,模板量一般为104～105 拷贝。如果未检测到产物或产物带很弱,可以采取以下措施:将反应产物在恒定退火温度下再反应10 个循环并重新分析;在恒定的退火温度下对起始DT PCR 产物的10 倍稀释物(1 :10～1 :1000) 重新作30 个循环的扩增;使用更多的模板量,并在原始PCR 混合物中掺入一定稀释度的阳性模板检测其中是否存在抑制物;改变缓冲液各成分的浓度(pH、Taq 聚合酶、dNTP、引物) ; 在PCR 混合物中加入增强剂;用嵌套式引物重新扩增第1 次PCR 产物的稀释物(1 :10～1 :1000) ;放弃此套引物,重新设计引物扩增。
如果观察到许多产物带或高分子量成片产物,可采取以下措施:提高DT PCR 的最高退火温度和最低退火温度,使其范围上移;减少最低退火温度条件下的循环次数;使各退火温度下的循环数增加一个,如3 个循环1 ℃,同时减少较低退火温度或恒定退火温度循环的次数以防过多循环形成成片产物;改变缓冲液各成分的浓度(pH、Taq 聚合酶、dNTP、引物) ;纯化产物带后重新扩增;用嵌套式引物重新扩增第1 次PCR 产物的稀释物(1 :104～1 :105) ;放弃此套引物,重新设计引物扩增。
