Patrick Paddison, Greg Hannon
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA
介绍
RNA干扰(RNAi)首先在线虫(Caenorhabditis elegans)和植物中发现，开始时认为是一种奇特的生物现象,但很快就成为这些生物系统强有力的基因研究工具。试验证明dsRNA(double-stranded RNA)诱导的基因沉默广泛存在于各种物种当中,包括植物、真菌、昆虫、原生动物以及真核生物等[1] 。通过研究小片段干扰RNAs(siRNAs)和表达后的shRNAs在哺乳动物细胞中的作用，研究人员发现人或鼠基因组的任何基因都能成为dsRNAs诱导基因沉默的靶向基因。因此，RNAi很快成为哺乳动物细胞体系研究的标准实验技术。
我们和其他一些实验室构建了用于哺乳动物细胞产生小片段dsRNA的体内表达载体,类似于内源表达的hairpin RNAs[2]。在试验中,我们利用U6 RNA polymerase Ⅲ启动子产生的含有反向重复序列(21-29核苷酸)的转录子来形成shRNA，它能被Dicer加工并进入RNAi途径。携带有shRNA表达载体的质粒短暂转染哺乳动物细胞足以引起基因沉默。令人惊奇的是,应用不同靶定效率的shRNA，能产生类似表观等位基因现象的一系列不同程度的基因沉默。
几个因素可能影响基因沉默的效率,像靶序列的特征、转染的效率以及靶向mRNA和蛋白的丰度及稳定性。对于表达的shRNA,我们推荐每个靶基因采用3-6个不同的发夹结构。大部分情况下,至少一个shRNA能引发高于90%的基因沉默。然而,在进行生物学试验前,一定要进行检测(western blotting,免疫荧光或者RT-PCR)确认是shRNA引发基因沉默。对于转染效率不高的细胞系,应进行多次转染从而提高基因抑制的效率。对于单次转染，应在转染后的48-96小时内进行基因抑制效率的检测。这里，我们报道了利用FuGENE 6 转染试剂转染NIH/3T3细胞引发暂时基因沉默的一种简单方法。
材料和方法
试验通过用早幼粒细胞蛋白(promyelocytic leukemia protein， PML)特异的shRNA诱导基因沉默,所用试剂为FuGENE 6 转染试剂, 细胞系为NIH 3T3,试验程序如下:
细胞培养
NIH 3T3细胞培养用培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基。
shRNA载体构建
PML,p53和Tyro29nt shRNA克隆入U6表达载体,方法参照Paddison和Hannon[2]
转染
细胞培养在6-孔板，每孔含2ml的培养基，细胞浓度为1×105/well，上板培养一天后进行转染。
转染试剂配置如下:在不含血清的DMEM培养基中稀释的FuGENE 6试剂与500ng shRNA载体按3:1的比例混合，温育15分钟。
细胞转染程序如下: 6-孔培养板的每孔中加入100μl含500ng shRNA载体(分别为PML-特异性的shRNA表达质粒、p53质粒或者Tyro29nt对照载体)的转染复合物，转染后16小时换培养基。
转染48小时后从细胞中提取总蛋白，细胞裂解液成份为0.2% NP-40、600mM KCl、50mM Hepes、0.2mM EDTA、0.2 mM EGTA和10% glycerol。其中另加入蛋白酶抑制剂(Complete Protease Inhibitor Cocktail)和deSUMOlase 抑制剂(2-lodoacetamide，calbiochem；N-Ethlymaleimide,Sigma)。
Western blotting
蛋白电泳采用8%的聚丙烯酰胺凝胶,上样量为每孔25μg蛋白。电泳后,蛋白被转移至尼龙膜。膜放置入封闭缓冲液TBST中(Tris缓冲液、5% 脱脂奶粉和0.05% 吐温)，23℃温育1小时。PML检测的一抗为鼠PML单克隆抗体(mAb37,CSHL)，抗体用TBST缓冲液按1:250稀释， 23℃温育1小时。然后用洗液(TBST)洗3次,每次15分钟。接下来将尼龙膜放入二抗溶液(鼠抗IgG HRP-conjugate，Upstate)，加入底物(Lumi-Light Western Blotting 底物),在X-ray胶片上检测信号。
结果
U6表达载体形成的小于30bp的shRNAs引发序列特异性的基因沉默[4].图1显示用FuGENE 6转染试剂诱导shRNA表达质粒转染NIH3T3细胞48小时后PML的抑制情况。从图可以看出,用PML-特异的shRNA表达质粒转染的细胞,PML的表达被强烈抑制。然而编码p53或者Tyro29nt特异基因的质粒转染后的细胞,PML的表达不受影响。
图1:转染PML特异性shRNA表达载体或p53-、Tyro29nt-特异性shRNA对照载体后，NIH3T3细胞总蛋白的Western blot
讨论
利用shRNA技术引发的暂时基因沉默拓宽了现代基因抑制技术的范围,给予研究人员在细胞学和疾病研究方面新的方向。我们的结果显示，在载体介导的哺乳动物细胞基因沉默的研究中，FuGENE 6转染试剂是一个有利的工具。
Reference
1. Hannon GJ(2002), Nature 11;418:244-251
2. Paddison PJ,Hannon GJ(2002), Cancer Cell 2:17-23
3. Hemann MT et al.(2003), Nat Genet 33:396-400
4. Passison PJ et al.(2002), Genes Dev 16:948-958
5. Paddison PJ et al.(2002), Proc Natl Acad Sci USA 99:1443-1448
