由于RNAi 强大的基因沉默效应,有人提出了RNAi 通路的效应扩增问题。RNAi 通路的效应扩增可能是通过细胞复制外源导入的dsRNA 或 siRNA 本身而实现的。另外,RISC 的多次反复使用也能扩增RNAi 的基因沉默效应。科研工作者通过对RNAi 效应增强子和效应抑制子的研究, 认为RNAi 是机体细胞一种强有力的基因调控机制。但是在哺乳动物细胞中导入外源大分子 dsRNA( > 30nt) 常常导致非特异性的基因沉默效应,因为它激活了核糖核酸酶RNaseL 而导致非特异性的RNA 降解。相反, siRNA ( < 30nt) 不激活 RNaseL ,而是通过序列特异性的方式诱导基因沉默效应。该序列特异性方式非常严格,一个碱基的错配会显著降低基因沉默效应。所以siRNA 可解释为一种具有3’两个核苷酸TT突出末端的 21～23nt 大小的双链核糖核酸,以RNAi 的中介分子形式特异性诱导目的基因的沉默。
3 siRNA 的获取
siRNA 可以经化学合成,因为siRNA 为一小段序列无酶活性,它只能诱导RISC 活化,活化的 RISC 特异性的切割功能,也可以通过体外转录获取。虽然理论上说,任何一个具有3’两个核苷酸 TT突出末端的19～23nt 小分子RNA 都可作为 siRNA。但是由于位置效应,比如某些序列,尤其是调控序列易被蛋白质附着而阻止RISC 的效应, 所以科研工作者首先合成2～4 个序列不同的 siRNA 进行预实验以选定作用效果最佳者。Am2 bion 公司可提供通过体外转录获取siRNA 的商品化试剂盒,使这一选择过程简单方便。
目前外源注射和转染是转运siRNA 到细胞或机体的主要途径。siRNA 导入后基因沉默效应持续数天后便很快消失。最近已开发出了siRNA 的表达质粒,达到在细胞内不断表达siRNA 的目的。 Invivogen 公司和Imgenex 公司都有操作简单、作用有效的商品化试剂盒提供。而Gene Therapy System 公司的siRNA 构建试剂盒则完全采用了不同的机制。该试剂盒首先PCR 合成目标序列,然后由T7RNA 多聚酶进行体外转录,经退火和纯化处理的体外转录dsRNA 模板被重组的Dicer 酶切割,从而快速、高效地产生大量小分子干扰RNA (siRNAs) 。产生的siRNAs 混合物,比单一形式的 siRNA 更可能导致基因表达沉默。
4 siRNA 的设计
基于目前的发表文献和一些实验经验,siRNA 的设计可遵循以下几点进行。①选择以碱基A 或G开始的19～21nt 大小的目的mRNA。因为 RNA polyMerase Ⅲ启动子只有在第一个转录碱基是嘌呤时才能有效作用。②针对目的mRNA 一般选择2～4 个不同序列,GC 含量为30 %～50 % ,避免四个碱基T 或A 的连续序列,避免选择起始密码下游50～100nt 、终止密码上游100nt 以及5’和 3’的非编码区域,BLAST检查设计序列的特异性。 ③设计适当的实验对照,比如设计有1～2 个碱基错配的序列,或者是随机变更siRNA 的碱基排列顺序。5 RNAi 存在的问题及应用前景
RNAi 作为一种调控基因表达的方法已在许多生物中进行了尝试,取得了一定的效果。许多研究已充分证实在秀丽新小杆线虫、果蝇等生物中,RNAi 是有效而且特异的,因此对这些生物而言,RNAi 不失为一种有价值的遗传学研究工具, 而这些成果得益于对这些生物中RNAi 分子机制的认识。目前对于RNAi 在哺乳类动物中的应用倍受关注。研究已发现在培养的人类细胞中确实存在RNAi 现象,使人们意识到RNAi 作为遗传学工具用于哺乳类乃至人类研究具有较好的前景。虽然RNAi 研究的历史很短,许多问题仍有待认识、解决,但随着对RNAi 机制的深入研究,RNAi将在功能基因组学、发育生物学研究,以及疾病的基因治疗等领域发挥巨大的作用。
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