反转录反应系统
1.RT和PCR单一酶系统
2.RT和PCR分离的酶系统
3.RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种：
1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物.
2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。
PCR 优化
PCR优化主要有：
1.引物的浓度
2.建议使用SYBR Green I和EvaGreen 进行扩增和溶解曲线的测试
笔者建议的操作流程:
I．靶的选择和试验设计
1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断
查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.
RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb),
PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)
Real Time PCR Primer Sets (http://www.realtimeprimers.org)
如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:
A.最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer(http://www.premierbiosoft.com)
B.DIY的软件Primer Express
C.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys http://www.designmyprobe.com)的服务方案,详细周到
D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序: http://www.biosearchtech.com/products/probe_design.asp
您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR
引物设计简介
DNA引物长度:15-25 个碱基
GC含量:50%左右
如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:<10 kcal/mol.没有连续的G/C.
引物探针的保存一般遵循以下原则:
正向和反向引物保存在-20度, 浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。
2.输入靶序列，用BLASTn在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast进行比对
3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计
4.在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。
5.考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过生物信息学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用基因组DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。
6.在RT步骤时，用(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi)工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低
7.尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60％或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是
的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3’区域
