4．siRNA表达框架
siRNA表达框架（siRNA expression cassettes, SECs）是一种由PCR得到的siRNA表达模板，包括一个RNA pol III 启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。它能够直接导入细胞进行表达而无需先克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆，测序验证等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不到一天就可以完成。因此，SECs是筛选siRNA的最简单有效的工具，可作为构建高效的体内转录载体进行RNAi研究的预实验，对不同宿主细胞优化筛选转录启动子和siRNA靶序列。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是PCR产物比较难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话，那可以解决很大问题。另外，不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能发生的误读不能被发现，可能会因此导致结果不理想。
三：转染细胞
由于siRNAs是进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此如何高效地将siRNAs转入细胞也是成功抑制基因表达地关键步骤。例如，一个siRNA分子对某特定基因地抑制效率为90%，而转染效率为10%，那么最后抑制蛋白表达最后地效率只有9%，可见如何提高siRNAs的转染效率非常重要。目前传统转染方法与转染试剂盒很难达到高效率的siRNAs转染，效果都不理想。QIAGEN公司的RNAiFect是专门的RNAi转染试剂，它的原理基于脂质体技术，适用于多种真核生物细胞，如AGS，HEK-293，HeLaS3, Huh-7, HUVEC, NIH-3T3等等。（具体效果见Figure 1）,而且试剂的细胞毒性很低。（见figure 13）
Figure 13: Cells were transfected and LDH activity in the cell culture supernatant was tested 48 hours later, using a colorimetric assay according to the manufacturer’s protocol. LDH activity in the cell culture supernatant of untransfected cells lysed be detergent was set to 100%. Background LDH activity was measured in untransfected and untreated cells, and this value was subtracted from all other measurements.
对于siRNA表达载体与表达框架等DNA的转染，可以选用常规的DNA转染试剂。
四．分析RNAi效果
RNAi分子水平的检测主要通过mRNA和蛋白两个方面进行检测。对于mRNA，可以采用RT-PCR，定量PCR，或Northern Blot技术等，通过信号强弱判断目的基因的沉默效果。对于蛋白水平的检测，克通过WB，ELISA，免疫荧光等。当然RNAi最大以及最终的效果是细胞的代谢过程，生理生化系数等参数发生明显的变化
