3．siRNA表达载体
化学合成和体外转录法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒，病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。
通过质粒表达siRNAs大都是用Pol III 启动子启动编码shRNA (small hairpin RNA)的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4-5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol III启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因的表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起其他合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。
此外，带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久。目前BD CLONTECH公司的RNAi-Ready pSIREN载体就是这样的产品（原理如figure 6）：
BD Clontech RNAi-Ready pSIREN载体采用U6启动子，均为线性载体。具体可分为两种:
pSIREN-Shuttle载体和pSIREN-RetroQ载体。（见figure 7）
pSIREN-Shuttle载体可以进一步应用于构建腺病毒，应用于感染难以转染的细胞。
pSIREN-RetroQ载体可以进一步应用于构建逆转录病毒，除了可以感染难以转染的细胞，还能通过与宿主细胞基因组DNA的整合，实现siRNA的细胞内长期稳定表达。同时，pSIREN-RetroQ载体还带有真核筛选标记----嘌呤霉素抗性基因。极大的方便了阳性转染细胞的筛选。
