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siRNA的设计与制备
作者:iris_palm 来源:丁香园 时间:2007-8-10

    试剂盒组成: T7 RNA聚合酶 (150 units/μl),10×缓冲液/NTPs,30×高分子量成分混合物(HMW),生物素化T7引物,LITMUS 38iluc 对照模板DNA (0.1 μg/μl)
    加工处理试剂: ShortCut RNaseIII (1.3 units/μl),10×ShortCut反应缓冲液,10×MnCl2 (200 mM),10×EDTA(250 mM),21 bp siRNA 分子量标准(1 μg),无RNA酶的糖原(10 μg/μl),10×缓冲液/NTPs。
    (见figure 3, 4, 5)

    Figure 4: 利用ShortCut RNaseIII制备siRNA: A) 不同量的ShortCut RNaseIII与分别与2 μg  500 bp的dsRNA反应20分钟。B) ShortCut RNaseIII消化dsRNA (1 kb和175 bp), 消化产物采用20% TBE聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

    Figure 5: 沉默COS-7细胞GFP的表达:将GFP表达质粒与采用ShortCut siRNA Kit制备的GFP siRNA(30 ng,4nM)共转染COS-7细胞;只转染GFP表达质粒的COS-7-GFP细胞作为阴性对照。转染后48小时进行拍照。

    非特异性siRNA合成,尽管特异性不强,无法确知有效靶片段,但相对经济,基因沉默效率高;可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤,为研究人员节省时间和金钱。不过这种方法的缺点也很明显,就是有可能引发非特异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因沉默。

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