2. 体外转录
1）长链dsRNA合成
如果研究对象不是哺乳动物细胞，可以采用较长的双链RNA诱导RNAi现象。我们可以DNA Olido为模板，通过体外转录合成dsRNAs，成本相对化学合成法而言比较低。目前市场上有很多这样的体外转录试剂盒，象NEB，EPICENTRE都提供类似的试剂盒。
2）特异性siRNA合成
多数生物尤其是哺乳动物，siRNA仍是诱导RNAi的最佳选择。以DNA Oligo为模板， 通过体外转录合成siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，一般只需化学合成的siRNA量的1/10就可以达到同等效果。这类方法主要适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，以及化学合成的价格成为障碍时。Epicentre MessageMuter™ shRNAi Production Kit 专为体外转录合成shRNA而设计，尤其适用于哺乳动物的RNA干扰研究。使用独特的3步法，在3小时内即可合成可以立刻转染的shRNA，比其他的体外转录方法更加快速、简便。该试剂盒提供足够的试剂合成10个不同的shRNAs，每个shRNA产物的量足够上百次常规细胞转染实验。此外，试剂盒还提供内参模板，每种shRNA的合成只需要合成一条寡核苷酸链即可。（见figure 2）
Figure 2: 首先以DNA为模板，通过体外转录合成双链长RNA（dsRNA），即将DNA克隆入LITMUS转录载体中。该载体携带相反方向的T7启动子，可利用单一T7启动子特异引物进行扩增，产生双链的DNA模板，其末端由T7启动子特异引物而决定，当使用其它PCR特异引物时，末端应该携带T7启动子。随试剂盒所提供的生物素标记T7启动子引物可用于扩增两个T7启动子间的所有序列。扩增后带有生物素标记的扩增片段可利用链霉亲和素标记的磁珠进行分离，并且直接用作转录模板。
3）非特异性siRNA合成
特异性制备siRNA方法的不足，是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法---制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒”就可以避免这个缺陷。这个方法通常选择200-1000碱基的靶mRNA模板，用体外反转录的方法制备长片段双链dsRNA，然后用RNaseIII或（Dicer）（大肠杆菌RNaseIII是一种识别双链RNA的内切酶，产物为3’端外悬2-3个碱基的双链短片段）在体外消化，得到siRNAs “混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的长链dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，转染方法和特异性siRNA一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能保证目的基因被有效抑制。NEB公司的ShortCutTM RNAi Kit 就是采用此类方法的试剂盒。该试剂盒不仅提供能在体外高效制备双链长RNA的转录试剂，而且还提供了高浓度RNaseIII酶（shortCut RNaseIII），能将转录后的片段切割成双链短RNA（18-25bp）。
