哺乳动物细胞中的RNAi技术
长链dsRNA所致的非特异干扰素效应：
科研人员开始试图将RNAi技术应用于哺乳动物细胞时，发现长链dsRNA（>30bp）并未引起特异序列的靶基因沉默，而是激活一组导致细胞死亡的非特异干扰素效应。
目前研究认为这种非特异效应可能是由于长链dsRNA促使干扰素合成并激活了两种酶：
dsRNA依赖的蛋白激酶（dsRNA-dependent protein kinse，PKR），PKR可磷酸化转录起始因子eIF2a；
2’，5’寡腺苷酸合成酶，其催化合成的2’，5’寡腺苷酸会激活RNase L。RNase L能够非特异地水解所有的mRNA。干扰素可加剧以上两种酶促反应，最终导致蛋白合成终止、诱发细胞凋亡。
~21nt siRNA介导特异靶基因沉默
近来研究发现通过导入~21nt的siRNA可在哺乳动物中介导序列特异的基因沉默 。这些siRNA长至可诱导特异基因沉默，短至可逃避宿主的非特异干扰素效应。 Harborth等曾用体外化学合成的21nt siRNA沉默靶基因成功。但因化学合成的RNA易被RNase降解而且成本昂贵，目前主要转向研究利用DNA载体在细胞内合成siRNA。
质粒载体表达合成siRNA的方法
第一种是设计可自然形成发夹的RNA（~22nt）:
两种RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）启动子（U6或H1）控制一段反向重复序列（中间被可变间隔序列分开）转录，结果可在胞内合成具有发夹结构的双链RNA（含19~29nt的茎和3~9nt的环），其中19~29nt的茎与靶基因序列互补。另外，此发夹RNA的3’末端含有4个或4个以下的尿嘧啶。实验证实， 3’末端为UU的RNA较AA、CC或GG为末端的RNA更能有效地诱导基因沉默。
第二种是将两个U6启动子串联在一起或置于两个分开的载体中以引导19nt的siRNA正义和反义链转录，正义、反义链在体内退火连接成双链siRNA。此siRNA中所含的19nt序列与靶基因互补，且siRNA的3’末端亦含4个或4个以下的尿嘧啶。
虽然由于内源性stRNA（miRNA）与靶基因不完全互补，它从翻译水平阻抑基因表达，但研究发现人工设计的与靶基因完全互补的修饰后的miRNA则可同siRNA一样在转录水平沉默基因，因此我们通过人工设计表达miRNA发夹前体（~70nt）的质粒载体也是RNAi技术的另一种方法。
Naturally occuring and artifical miRNA (serving as siRNA)
