RNAi途径主要存在于细胞浆中，但是siRNA产生、靶mRNA降解的亚细胞位置尚未明确。外源性（注射或喂养）的dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接进入细胞浆中的RNAi途径，仅在细胞浆中复制的RNA病毒可被dsRNA介导的沉默机制所抑制。外源性dsRNA则还可导致细胞核中的同源早期RNA转录产物减少。
在许多机体中反向重复转基因序列在细胞核内转录成发夹dsRNA，进而可介导RNAi，这种dsRNA可能需要转移至胞浆中才可有效地沉默同源靶mRNA。
例如，在果蝇中，转录含有内含子和多聚腺苷酸信号的发夹dsRNA的反向重复转基因序列比转录不含内含子、不含多聚腺苷酸信号dsRNA的转基因序列更能有效地沉默同源靶mRNA（因为内含子和多聚腺苷酸信号有利于dsRNA转移入胞浆）。
另外，内源性的小的短暂RNA（small temporal RNA，stRNA，为一种修饰后的miRNA）也可作为siRNA发挥基因沉默作用。stRNA（miRNA）是~70nt发夹RNA （发夹miRNA 前体，miRNA hair precursor）被RNaseⅢ样核酸酶切割加工成的单链~22nt RNA。由于stRNA与靶基因不完全互补，它从翻译水平阻抑基因表达。
除上述RNAi机制外，转基因真核生物中的dsRNA尚可引起相应基因的甲基化和染色质重构、凝集、异染色质化，基因甲基化和异染色质化还可能促使异常RNA（aberrant RNA）产生，最终导致基因沉默。
RNAi的放大效应机制
siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。
新合成的长链dsRNA同样可被RNaseⅢ样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（random degradative PCR）。
RNAi降解mRNA的过程
RNAi 的特点
转录后水平的基因沉默
较高特异性：能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。
高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制。
可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，可传递给子一代。
