按照RNA分离操作方案在完全移去水样层后,匀浆中的DNA存在于中间层和苯酚层中也可以被分离出来。在沉淀和多次洗脱后,DNA溶解在8 mM NaOH中。用TRIZOL试剂从组织和培养细胞中完全回收的DNA可以用来做样品中DNA含量的测定。同时抽提的基因组DNA可以用于对Northern analysis的结果进行标准化,因为基因组DNA变异程度比总RNA或组织重量要小。[由于来源的不同,所得到的DNA沉淀在进一步应用前可能需要额外的纯化步骤(例如苯酚抽提等等)。]
实验所需但试剂未提供的物品:
* 酒精
* 0.1 M柠檬酸钠(用10%酒精配制)
* 75%酒精
8 mM NaOH
如无例外,以下操作均应在15—30℃下完成。
1.DNA的沉淀
移除中间层上残余的水样层,用酒精从中间层和苯酚层中沉淀DNA。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加0.3 ml的无水乙醇,反复颠倒来混合样品。然后将样品置于15—30℃下2—3分钟,再在2—8℃下以不超过2,000×g的离心力离心5分钟沉淀DNA。
小心移除水样层对抽提的DNA的质量至关重要。
2. DNA的洗脱
移除离心后苯酚层中的上清液,如有必要,可以将其保留用于抽提蛋白。用0.1 M柠檬酸钠(用10%酒精配制)洗涤DNA沉淀两次。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加1 ml柠檬酸钠溶液。每次洗涤时洗涤液要和DNA沉淀在15—30℃下作用30分钟(期间周期性混匀)再在2—8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。在两次洗涤完成后,用75%的酒精重悬DNA沉淀(每1 ml TRIZOL加1.5—2 ml75%酒精),在15—30℃下放置10—20分钟(期间周期性混匀)然后再在2—8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。
对于较大的DNA沉淀(> 200 μg)或样品中含有较多的非DNA物质需要用0.1 M柠檬酸钠(用10%酒精配制)溶液再洗涤一次。[生物秀 www.bbioo.com]
3.DNA的再溶解
在开口的试管中空气干燥DNA5—10分钟。(不要用离心干燥;它会使得DNA极难溶解。)用8m M的NaOH溶解DNA,大致的比例为0.2—0.3 μgDNA/μl。一般来说,每107个细胞或每50—70 mg组织要加300—600 μl的8m M的NaOH。用弱碱再溶解DNA是高度值得推荐的,因为抽提的DNA在水或是Tris缓冲液中都不能很好再溶解。8m M的NaOH的pH值只有~9,一旦DNA溶于其中后可以很容易用TE缓冲液或HEPES再调整其pH值。在本步骤中,DNA样品(尤其是来自组织的样品)可能含有一些不溶解的胶样物质(细胞膜碎片等)。以>12,000×g的离心力离心10分钟来除去那些不溶的物质。将含有DNA得上清液转移到一新的试管中。溶于8 mM NaOH中的DNA可以在4℃下放置过夜;如果是长期保存,样品中还应该用HEPES将pH值调到7—8(见表)并加入1 Mm的EDTA。H值调整好后,dna可以保存于4℃或–20℃。
DNA的定量及预期的产量
取一小份溶于8 mM NaOH中的DNA样品,以适当比例和水混合并测量混合液A260值,以双链DNA的A260值计算DNA含量。每一A260单位相当于50μg双链DNA/ml。若以细胞数分析其相应的DNA产量,大致遵循以下比例:每1×106个分别来源于人,大鼠,小鼠的二倍体细胞分别对应于7.1μg, 6.5μg,和5.8μgDNA。
应用:
通过PCR扩增DNA:
在DNA再溶于8mM NaOH后,用0.1 M的HEPES(见表)将其pH调到8.4。加0.1到1.0μg的DNA样品到PCR反应体系中并执行标准的PCR反应。
