在果蝇的研究中同样发现了RNAi。尽管采用能生产dsRNA的酵母喂食果蝇实验以失败告终,但是通过显微注射或者通过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中、或者将带有反向重复序列的DNA导入果蝇中能够引发基因沉默。在过去的几年中RNAi技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传工具,用于鉴定功能缺失表型。
注射的RNAi如何引发基因沉默?在过去的数年中多个研究小组进行了不懈的努力。Baul combe和Hamilton首先在发生协同抑制的植物中鉴定出一些在没有发生基因沉默的植物中并不存在的大约25个碱基大小的RNA,这些RNA分别与沉默基因的正义和反义链互补。这成为揭示RNAi秘密的第一条关键线索。
后来在果蝇细胞中的实验进一步揭示这个秘密。在一系列著名的实验中,Zamore 和同事发现注入果蝇细胞的dsRNA被切割为21~23碱基长短的RNA片段,他们同时发现:与dsRNA同源的内源基因的mRNA,只在和dsRNA对应的部位被切割成为21—23核苷酸长的片断。很快,RNAi的机制越来越清楚了
RNAi技术的专有名词
1.RNAi:(RNA interference)RNA干扰
一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA interference,RNAi,也译作RNA干预或者干涉)。它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。
2.siRNA:(small interfering RNAs)小干扰RNA
一种短片断双链RNA分子,能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA,这个过程就是RNA干扰途径(RNA interference pathway)。
3.shRNAs:(RNA-Short hairpin RNAs)短发夹RNA是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,短发夹RNA能够通过RNA干扰来抑制基因的表达。Thomas Rosenquist's group和Greg Hannon's group联合研究了在哺乳动物种系细胞中shRNAs的转移导致基因长时间稳定沉默的机制。4.bp:(Base Pair)碱基对两个碱基(A和T,或者C和G)之间靠氢键结合在一起,形成一个碱基对。DNA的两条链就是靠碱基对之间的氢键连接在一起,形成双螺旋结构。
5.Base sequence:碱基序列DNA分子中碱基的排列顺序。6.Base Sequence Analysis:碱基序列分析分析出DNA分子中碱基序列的方法(这种方法有时能够全自动化)
cDNA:参见互补DNA。
7.cDNA:互补DNA以信使RNA为模板合成的DNA,常常采用互补DNA的一条链作为绘制物理图谱时的探针。
8.Complementary sequence:互补序列以一条核苷酸链为模板,根据碱基互补规则形成的互补链,称为该模板的互补序列。9.Genomic Library:基因组文库对某个染色体,制备随机产生的、相互之间有重叠部分的片段的克隆。
10.RISC:(RNA-induced silencing complex)RNA诱导沉默复合物
在RNAi效应阶段,siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物。激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA(3, 18, 27, 29)。尽管切割的精确机制现在还是未知,研究表明每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。
11.Dicer:Dicer酶
RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员,能以一种ATP依赖的方式逐步(processive)切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA,切割将RNA降解为19—21bp的双链RNAs(siRNAs),每个片断的3'端都有2个碱基突出(27, 28)。
12.PTGS:(Post-transcriptional Gene Silencing ,PTGS)转录后基因沉默部分的植物中的基因沉默是在转录后发生的。它是相对于部分植物中发生的转录阶段的基因沉默(TGS)而言的。13. TGS:(transcriptional gene silencing)转录阶段基因沉默

