对照的包装实验感染倍数(m.o.i)为15的Ad5型在无血清培养基中培养1h，随即进行转染。Ad通过在Hela细胞上的噬斑形成滴定。 Fig.1. rAAV包装所用的质粒(A)pTR-UF5含有CMV启动子(箭头)所驱动的人gfp基因和HSV－tk启动子(箭头)所驱动的neoR基因。整个构建的两侧有AAV TR元件(填充的方块)。pAVbgal含有E.coli b-半乳糖苷酶基因，受CMV启动子(箭头)所控制。转录盒两侧是AAV TR元件（填充的方块）。pAAV/Ad含有AAV rep 和cap基因，两侧是Ad末端重复元件（空方块）（B）pSH3和pSH5含有Ad E4,E2a和VA RNA基因。两个质粒也含有AAV rep和cap基因。图下的数字指的是Ad和AAV基因组中的核苷酸数目。pSH3和pSH5的区别是在AAV DNA序列中的方向。为了清楚，质粒图谱的其余部分未列。
2.2. rAAV载体产生和滴定 对于小规模的包装实验，8´105 293细胞在35mm6孔盘上种植。24小时后，根据生产商的方法用lipofectamin（Life Technologies）一式三份转染培养物。对于开始的优化实验，所用的载体对辅助质粒的比例在表1列出。根据载体和辅助质粒的大小，1mg:3mg比例相应于1:1的pTR-UF5对pSH3/5的摩尔比。pAAV/Ad质粒与Ad共感染，3或5mg的pAAV/Ad与1mg的pTR-UF5共感染。pGEM3Z质粒(Promega)被共转染后保持不同转染的相同总DNA浓度。对于伴随Ad感染的转染，在加入DNA到细胞前病毒被吸附到无血清培养基中细胞单层上1h。转染后72小时，细胞被刮到2ml培养基中收获起来。细胞随后用1ml无菌PBS清洗。PBS清洗液加到细胞悬浮物中，冻融5次后超声破碎(3,36mm 45s)。提取物在4000´g离心10分钟去除细胞碎片，裂解液上清含有重组载体vAVgfp，它将被用到随后的转导中。在转导之前，这些转染的Ad用 56°C热处理30分钟。 对于大规模载体包装，20´1 5cm的培养盘，每个含有5´106 293细胞，以及用钙磷酸盐沉淀方法(Wigler等,1979)转染了10mg pAVgal和50mg pSH3。72小时后，收获培养物，低速离心沉淀细胞，沉淀冻融4次，如前所述超声破碎。CsCl2加到裂解物中，终浓度为1.41g/ml，用折射指数确定。悬浮物在SW41转头上40 000rpm离心48小时。将含有可见载体的条带从梯度中去除，其密度可通过测量折射指数来确定。CsCl2离心步骤重复，获得的载体制备后进行透析，更换4次PBS，保存在－80°C。产生的载体vAVgal按下述方法滴定。 为了确定rAAV的滴度，4´104Hela细胞被种植到24孔培养盘中，感染m.o.i为10的Ad，用系列稀释的转染细胞裂解液进行转导。2、3天后，在广泛细胞病理效应被发现之前用带有EPI-荧光设备的DIAPHOT-***理光倒置显微镜在20倍下观察。计数产生良好分离的荧光细胞载体的稀释倍数。因而，每个阳性细胞代表了一个载体转导单位（T.U.）。为了确定rAAVgal载体的滴度，纯化载体的稀释液被用来感染细胞。细胞用PBS溶解的95％甲醇固定，用X-gal显色。每个蓝染的细胞代表一个载体转导单位(T.U.)。 载体基因组拷贝数用点印迹杂交分析来确定，如前所述方法测定A260(Fisher et al.,1996)。对于6孔盘的小规模包装实验，制备的原始载体用DNase I在37°C处理30分钟。DNase 在75°C灭活，蛋白质用50mM Tris 1mM EDTA 0.1%SDS 0.5mg/ml蛋白酶K在37°C消化12小时。对于CsCl2纯化的载体，使用相同的步骤，但不用DNase步骤。载体DNA煮沸5分钟，用Bio-Dot装置(Bio-Rad)加到硝酸纤维素膜上（Schleicher和Schuell）。每个孔用0.5M乙酸胺300ml(pH5.2)洗涤。洗涤印迹按照2.4部分 Southern blot方法处理，载体特异的探针标记，暴露于Kodak X-omat X线胶片(Eastman Kodak)。比较载体杂交信号与已知稀释浓度印迹到同样滤膜上的质粒DNA，精确估计基因组拷贝数。用Ambis Image Acquisition and Analysis系统定量杂交滤膜上的放射性和X-线胶片上的光密度。
2.3 蛋白质分析 为了分析AAV Rep和Cap蛋白质表达，按照2.2部分所述进行质粒转染。转染后48小时，将培养物刮到冷PBS/Mg(PBS含有5mM MgCl2)，细胞低速离心沉淀收获。细胞沉淀在冰上用200ml STM-NP缓冲液(25mM蔗糖,10mM Tris-HCl，pH8.0,10mM MgCl2,0.5%NP-40,1.0mM PMSF, 0.1Mm DTT)中裂解。裂解物2000´g离心5分钟获得核沉淀。核沉淀在200ml IPP缓冲液中重悬，冰浴45分钟并经常涡旋。核抽提物在14 000´g离心去除DNA和核碎片。上清液与SDS-PAGE样品缓冲液混合，100°C加热5分钟，14mA 10%SDS-PAGE凝胶分离过夜。用一个Trans-Blet SD 半干转移槽(Bi－Rad)转移蛋白质到硝酸纤维素膜上。滤膜在PBS溶解的2％奶粉阻断1-2h，随后用兔抗Rep（Trempe等，1987）或仓鼠抗Cap（American Type Culture Collection）一抗(含有1%奶粉的PBS稀释200倍)室温孵育2小时或4°C过夜。印迹用含有0.05% Tween-20的PBS洗涤3次，每次10分钟。合适的碱性磷酸酶缀合的二抗用含有1％奶粉的PBS稀释2000倍，室温下孵育孵育印迹1小时。用PBS-Tween-20缓冲液洗涤3次，印迹用溶解在二甲基甲酰胺的NBT和BCIP染色5－20分钟。
2.4 DNA分析 为了分析病毒DNA，包装转染按照2.2部分所述进行。转染后48小时，将培养物刮到冷PBS/Mg，低速离心收获。染色体外DNA用Hirt的方法(Hirt,1967)从细胞外分离。简单地说细胞沉淀在200ml裂解液(10mM Tris,pH8.0,1.0mM EDTA, 1.0%SDS)中重悬，加热40mg蛋白质酶K。37°C消化2个小时后，加入50ml 50M NaCl,冰浴4h。溶液在4°C 14000´g离心30分钟去除染色体沉淀。上清液用5ml RNase混合液(Ambion, 5mg RNase A,100单位RNaseT1)37°C处理2小时，用酚/氯仿(1:1)抽提1次，再用氯仿抽提1次。DNA用2倍体积的乙醇沉淀，用DpnI处理去除输入的质粒DNA。DNA在琼脂糖凝胶 上分离，按上述方法转移到硝酸纤维素膜上(Hirt,1967)，用Stratalinker (Stratagene)将其UV交粘到滤膜上。滤膜用gfp基因特异的32P探针 或者AAV特异的探针杂交。如前所述进行杂交和洗涤。用随机标记试剂盒制备杂交探针。膜暴露于X线胶片。 为了估计rcAAV的量，1´106 293细胞感染了Ad（m.o.i）和CsCl2纯化的野生型AAV或vAVgal的稀释液。用pAAV/Ad或pSH3/5作为辅助质粒转染制备的vAVgfp原液被用来转导Ad感染的细胞。48小时后，培养物被收获，病毒DNA被制备并通过琼脂糖凝胶电泳和Southern 杂交分析。
3.结果
3.1 用AAV/Ad辅助质粒的rAAV包装 制备重组AAV载体的最常用的实验方案包括用含有目的基因、病毒TR元件的AAV为基础的载体质粒和提供Rep和Cap蛋白质的辅助质粒共转染Ad感染的组织培养细胞。一个最常用的辅助质粒是pAAV/Ad(Samulski 等,1989)。这个方法的主要缺点是在载体原液中污染Ad、生成能够复制的AAV，而且整个过程的低效率。为了克服这些问题，我们构建了一个新型的含有AAV rep和cap基因以及Ad E2a,E4和VA的辅助质粒。当质粒与高度易转染的293细胞系联合使用(Graham等,1977)时，它含有Ad E1a和E1b基因，所有包装rAAV载体所需要的成分都存在。为了测试这些质粒是否能够包装一个AAV为基础的载体，我们用表达绿色荧光蛋白的pTR-UF5（Peel等，1997）质粒和辅助质粒共转染到293细胞中(Fig1A)，用的是lipofectamine的方法。为了确定两个质粒的最佳比例我们使用了几个不同比例。作为对照，我们同样使用了Ad-5(15m.o.i)感染293细胞，然后用载体质粒和pAAV/Ad作为辅助质粒转染它们。72小时后，按2.2部分的方法收获细胞、裂解准备转导。裂解液一式三份被用来转导Ad感染的Hela细胞。绿色荧光细胞3天后用荧光显微镜计数。几个实验的结果在Table1.列出。很明显在这些包装效率与pAAV/Ad辅助质粒相比较的实验中，我们用pSH3和pSH5质粒获得了更多的rAAV。我们用辅助质粒常规地比pAAV/Ad和Ad感染获得更多的rAAV。每个细胞的最高产出135T.U.比pAAV/Ad对照所获得的高80倍。在其它载体质粒比辅助质粒更多的比例没有产生大量的rAAV。随后用点印迹杂交确定的基因组拷贝数目揭示了颗粒－感染比率对于表达gfp的载体在Ad感染的Hela细胞中大约是100。这样这些实验获得的最高得率大约是每个细胞1.36´104 DNase抗性基因组。这些实验表明了pSH3和pSH5质粒完全支持无Ad共转染情况下高效率的rAAV包装。
