* 计算实例
DNA分离,CSCL梯度,初始密度1.70g/cm3,根据离心要求,理想的
最大密度为Sb=1.75 g/cm3
最少密度为St=1.65 g/cm3
用某甩平转头最高转速55000rpm,
rb=12cm,rt=6.7cm则N=45500rpm,
校核:由于密度>1.2 g/cm3按规定这个转头的最高转速不能超过:
=46200rpm
46200rpm>45500rpm
所以,以上设计成立。
* 离心时间计算:
计算例题中离心所需要的时间:
已知r平均=9.35cm,样品S20,w=15

* 讨论
必须注意不能使CSCL在离心管底部最大密度超过1.90 g/cm3120oC)否则CSCL将可能析出结晶,而CSCL的结晶密度为4 g/cm3,很可能在结晶的局部损坏塑料离心管,从而造成CSCL泄漏而进一步腐蚀转头,(特别是铝合金转头)而造成转头在离心中炸裂的严重事故。为安全起见,生金属的梯度实验不要去铝合金转头或甩平转头中的铝合金吊桶中做。
(IV) 预形成梯度:
* 不连续(阶梯形)梯度:
分层铺设不连续梯度,样品铺在梯度液之上,离心时不同组份越过少于本身浮密度时梯度层次而最后达密度样品浮密度的梯度界面之前形成纯样品区带。一般设置三至五个层次。
* 连续梯度
根据被分离样品的性质设计线性,凸指数,凹指数或凹凸复合指度曲线梯度。样品一般铺在梯度液上部离心分离,要注意的是某些梯度材料(如重金属器)预形成梯度在离心过程中由于离心力和浓度扩散的复合作用而可能改变形状。
我们也可以用离心来制备预形成梯度,如果形成的梯度曲线(近直线型)中点的密度和初始刻度相同则梯度的稳定时间(对CSCL)
若在3/4处(从液面算起)密度与初始密度相同则
当然这是用于估计形成不同CSCL梯度曲线所需要的时间的经验公式。它可用以实际离心操作。
(V) 为了使实验人员对不同生物体组份在不同梯度材料中的浮密度右外初步认识,列下图供参。
图中
(a) 在水或在0.25M蔗糖液中的推定浮密度
(b) 在等密度蔗糖液中推定浮密度
(c) 在等密度CS2SO4中推定浮密度
(d) 在等密度CSCL中推定浮密度
序数符号表示为:
①细胞核 ②质膜 ③细胞质 ④细胞核 ⑤线粒体 ⑥溶酶体 ⑦线粒体 ⑧溶酶体 ⑨内质纲 ⑩病毒
(1)核蛋白体 (2)核糖体 (3)DNA (4)蔗糖温表 (5)核糖体(6)DNA (7)RNA (8)RNA (9)RNA
附图 各种生物体组份在不同梯度材料溶液中的浮浓度示意
参考文献
(1)B.D.Hames "Choice of Conditions for Density Gradient Centrifugation"IRL press.oxford 1984
(2)M.Dobrota,R.Hinton "Conditions for density gradient Separations" Oxford University press .1992
(3)D.RickWood,B.D.hames "Centrifugation,Essential Data" Wiley press.1994
(4)C.A.Price "Centrifngation in density gradients"Academic press.New York 1982
(5)余兴明,"质粒DNA的超速离心分离"
"生命的化学"1994.1
(6)余兴明"血清脂蛋白的离心分离"
"生命的化学"1997.3
(7)余兴明"离心技术"设备与方法概论
上海生物物理学会1986,1993年


