常用的梯度材料有:蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇、酒石酸钾、溴化钠、溴化钾、碘化钠、碘化钾、氯化铯、氯化铷、硫酸铷、三氯(耳苯酸钩、三氟醋酸铯、右旋糖苷,白蛋白、Ficoll, percoll, mettizamide, Nycodebnz, Ludox, Dextian等等
(III) 梯度形状的选择:
所谓梯度形状是指梯度介质没着离尽管长充方向的密度变化特征。
用于R-z离心密度梯度常用连续梯度也变是密度随着离心本径的增加而光滑地(不是实变化)增大,直线型的,光滑曲线型的(一般用凸指数或凹指数曲线,或凸凹指数曲线联用的)都属于连续梯度。不连续(阶梯型)梯度采用于等密度离心。
*线型:
在甩平转头中做R-z离心最常用线性梯度。
制各线性梯度时要注意:
(a) 在甩平或垂直转头中制各线性梯度时,梯度液西的密度必须足支持样品,而底部密度必须少于被分离样品组份的密度。
(b) 一般地说较大的梯度斜率可以得到较高分辨率
(c) 蔗糖的常用线性梯度范围是5~20%W/V或10~40%W/V
(d) 可以用梯度议制各线性梯度,也可以人工辅设整个价梯型梯度,离心管二静置一致时间后也可以形成近线性梯度。
*等运动梯度(等速梯度)(Isokinetic)
等运动梯度是指在某一恒定离心转速时,样品颗粒在梯度中以定常速度沉降。在做到等速沉降,必须使梯度和粘性力的增加与沿着离心本径方向的离心力增加相平衡,在这种梯度液中,颗粒的沉降距离与离心时间,离必力,以及颗粒本身的沉降多数成正比。因此如果已知某单一组份样品的沉降分数,就可以算出在同一梯度中沉降的其他组份的沉降系数。
在甩平转头中用等速沉降梯度时,从旋转中心算起的离心距离与沉降系数的关系应该是线性关系。
为了构造等速沉降梯度种慢必须注意到转头、离心管,梯度合质的密度,浓度和粘性系数在同一温度。
在甩平转头中作蛋白质分离常用5~20%(W/V)的蔗糖梯度在5摄氏度离心可以达到近似的等速沉降的效果,而10~30%(W/V)的甘油梯度在5摄氏度时分离DNA或RNA也可以达到近似等速沉降的目的其他大金数样品分离的等速沉降梯度是凸指数型曲线。
*凸型指数曲线与凹型指数曲线梯度:
为了支持样品使其中组份在离心开始前不致于沉入梯度,我们常常望梯度曲线在近度面处有较陡的斜率,也就是说在近液面处梯度液的密度沿离心管长度方向增加得很快。这就是凸指数曲线梯度,与比相反,如果液面处梯度液足以支持(托住)样品,故虑到某些样品在离心管中下部需要较慢的沉降率(在高密度区)才能得到理想的分辨率,那么凹型指数曲线型梯度变能满足这个要求。
*复合型梯度:
如果用程序梯度仪来制备梯度,那么上节中的凸凹指数曲线梯度可以复合在同一梯度液中,这样的复合梯度在它们各自的区域保持了它们各自的优点。当然也制备其他类型的复合梯度。一般说,复合梯度多用于区带离心。
(2)等密度离心,梯度要素的选择:
(I) 梯度材料及梯度溶液选择:
所有的等密度离心都使用水溶性缓冲剂作溶剂,缓冲剂的组成及PH值取决于生物样品的性质。对细胞,亚细胞结构或其他生物大分子的等密度离心分离各有不同要求。
常用于等密度离心梯度材料有:
|
材料名称 |
DNA |
RNA |
核蛋白 |
膜 |
亚细胞器 |
细胞 |
病毒 |
|
蔗糖 |
不适合 |
不适合 |
可用 |
较好 |
较好 |
可用 |
较好 |
|
Ficoll |
不适合 |
不适合 |
不适合 |
可用 |
可用 |
最佳 |
较好 |
|
CSCL |
最佳 |
较好 |
最佳 |
不适合 |
不适合 |
不适合 |
较好 |
|
Percoll |
不适合 |
不适合 |
不适合 |
可用 |
较好 |
较好 |
可用 |
|
Nycodez |
可用 |
可用 |
最佳 |
最佳 |
最佳 |
较好 |
较好 |
从上表可以看出,对R-z离心蔗糖是很好的梯度材料,而对于等密度离心,不同的生物样品对梯度材料的要求有较大差异。


