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密度梯度离心基础知识
作者:余兴明 来源:中科院上海生物化学研究所 时间:2007-8-5

    2、 各种转头用于密度梯度离心的比较:
    (I) 各种转头用于速率一区带(R-z)离心的优缺点分析:
      固定角式转头:壁部放应影响很大,用于R-z离心回、收率低,纯度也受影响一般知用于差分离心和等密度离心,离心时间向较短。是各其离心机的最高速转头。
      甩平转头:细长离心管用于R-z离心可以获得较高纯度和高分辨率,且容易控制离心时间,壁部入在很少。25000rpm~30000rpm的甩平转头最适用于亚细胞器的离心分离,而40000~42000rpm的甩平转头适合用于核酸、蛋白、病毒草类物质内流的分离。离心时间较长。
      垂直管转头:沉降距离最短,因而离心分离时间也是短。最大半径前几乎没有壁部放位,最大本径后右一定壁部效位,垂直剖面积较大,因而离心后纯样品区带的容量也较大。但在有沉殿的密度梯度离心中,沉淀和浮动区带方向转换之间存在干扰,可能影响纯样品区带的纯度。大部份R-z离心没有沉殿,垂直管转头很适合做R-z离心。
      近垂直管转头:管轴线与旋转主轴之间倾角7度~9度(角式转头20度~45度)沉降距离比垂直转头稍大,离心时间比角式,甩平转头都要短。由于右了倾角,沉殿可沿管壁滑向低部,因此基本上清除了沉殿与浮动区带转换之间的干扰,适合做R-z离心,特别适合做生物大分子(如质粒DNA)的自形成梯度等密度离心。
      区带转头:没有壁部入应特别适合做大容量的病毒,亚细胞器,生物大分子的R-z离心,可用于研究,中试和少批量生产。分离纯度高,量大,但操作要求高,转头及整体价格昂贵。
      连续流离心转头:工作原理的区带转头相似,可连续工作,分离量大,分离统纯度高,可用于各种生物体的差分,R-z等密度离心。近年来高速连续流转头常用于大量发酵液(大肠样菌、酝母菌)菌体的沉殿。
    (II) 各种转头用于等密度离心内优缺点分析:
      固定角式转头:主要用于差分离心的角式转头,在速离心机上可以很好地用于等密度离心,尤其是DNA平衡等密度离心,自形成梯度,用快速密封管或厚壁管,常用的单管的容量为10~15ml,常用转速40000~60000rpm,离心时间较短,分离纯度也较高。
      甩平转头:用作等密度离心时,壁部效应对分离效果影响较少,梯度变换在甩平时自然过渡因而很适合做等密度离心实验,优点是回收率高,分辨能力强。缺点是沉降距离长,最高转速较低(由于结构层固此类转头最主转速一般在60000rpm以下)因而,离心时间很长,对某些长离心管,10~15ml容量的转头最高转速在40000~41000rpm,用作自形成CSCL梯度的质粒DNA离心往往需要50~70小时。
      垂直管转头:适合作等密度离心,沉降距离最短,在没有沉殿或沉殿非常坚实的情况下,对于现代可自由选择加速、减速时间的离心机,梯度转换得很好。这类转头转进很高(目前最高转速可达100000rpm,70000xg)离心时间最短,分离纯度高,样品容量较大(垂直剖面积最大)。
      近垂直转头:九十年代以后开始使用的新型转头,用作生物大分子(DNA,RNA,蛋白质等)的平衡等密度离心最佳,目前这类转头的最高转速已达90000rpm近650000xg),离心时间相比垂直转头稍长。
      区带转头:非常适合做大容量样品的等密度离心
      连续流离心转头:高、低速连续流转头一般不用作密度梯度离心超速连续流转头适合做大容量样品的等密度离心分离。
    (三)密度梯度--材料和梯度型式的选用
    1、 对于速率--区带密度梯度离心,梯心度选择要点
    (I) 概述:用速率一区带法下简移尺R-z法进行分离的主要原理是依靠不同样品在梯度中沉降速率的不同来分离(比化样品,因此希望样品在沉降能通过整个离心管长度的提高分辨率。作为最基本条件就是梯度液的最大密度必须少于样品颗粒的密度。
    用有密度梯度的支持液作R-z离心有以下优点:
    *当样品中不同组份分层进入梯度液时,梯度的较高密度支持着样品这样就使样品各个不同密度的层次以较窄(或较薄)的区带沉降从而得到期较高的分辨率(或较高的纯度)
    * 梯度液的密度一般是从离心管上部到底部逐渐增加,这样就可以稳定液栓,提示抗对和抗机械扰动的能力(接近离心过程结束时,纯样品区带和它的支持液的密度差较少)
    * 梯度液粘性系数逐渐增大也使纯样品区带变窄从而提示了分辨率而逐渐减缓的沉降速度使同一组份样品逐渐靠扰,提高了分离纯度。
    (II) 梯度、材料的选用
      一个理想的梯液就具备:化学稳定性好;高溶合度;低渗透性;在溶剂中稳定性;较低的光吸收特性;价廉等。遗憾的是很难找到一种适合于各种R-z离心的完美无缺的梯度液。
      对于大参数R-z离心,蔗糖是比较合适的梯度材料。尽管它在高密度(>30% W/N)时粘性每数较大,但综合比较表明它可以广泛应用。但由于蔗糖在各种密度时(即使是低密度时也如此)右较高的渗透性,分离一些对渗透性敏感的生物体组份时需要选择其他梯度材料,如由pharmacia公司开发的Ficoll等等。
    在大多数情况下,梯度液的PH值应与被分离时生物样品的生理PH值一致。
    对密度梯度材料的基本要求:
    a) 能够配制所需要的密度范围
    b) 粘性系数较低
    c) 溶合度高
    d) 有密度与光折射率的对照资料
    e) 对被分离样品无损害
    f) 对被分离样品渗透很少
    g) 在离分离完成后很容易与生物样品分离
    h) 化学了性放稳定
    i) 对离心过程中所接触的转头材料,离心管,管盖及密材料,连续流及区带转头的管道等等无腐蚀作用
    j) 纯度高
    k) 毒性少
    l) 价格较低
    m) 已知该材料的某些物理、化学、热力学性能。

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