1.2.1 培养细胞 MA 104细胞在含有10%小牛血清的MEM培养基的100 ml方瓶中培养。当细胞长至单层时，用PBS洗细胞3次，留待病毒感染用。
1.2.2 病毒的增殖 Wa病毒液用10 μg/ml乙酶在37 ℃水浴中孵育1 h，加入用PBS洗过3次的MA 104单层细胞中，每瓶加0.5 ml。37 ℃吸附1 h后，加入不含小牛血清的 MEM维持液，放37 ℃恒温培养箱培养至90％左右细胞出现CPE时收获，-20 ℃冻融3次，4 ℃ 5000 rpm，30 min离 心，收集上清液（病毒液）。
1.2.3 病毒浓缩 （1）PEG沉淀病毒：在收集到的病毒上清中加入5％的PEG 6000，4 ℃搅拌过夜（约18 h）。4 ℃ 10000 rpm离心1.5 h，弃上清。沉淀用TNMC缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5,100 mM NaCl,10 mM CaCl2，1mM MgCl2）悬浮，于4 ℃ 50000 rpm离心1 h，弃上清。沉淀用TNMC缓冲液重新悬浮，使其终体积为浓缩前的1%。（2）三氟三氯乙烷抽提：取一半PEG浓缩的病毒液，加入等体积的三氟三氯乙烷抽提1次，4 ℃ 12000 rpm离心10 min，收集水相。有机相再加入1/10体积的缓冲液抽提1次，同前离心，回收水相并合并。收集的水相用缓冲液10倍稀释，4 ℃ 50000 rpm离心1 h，弃上清，沉淀用TNMC缓冲液悬浮，使其终体积同抽提前。
1.2.4 CsCl密度梯度离心 分别取相同体积的上述未经三氟三氯乙烷抽提和经三氟三氯乙烷抽提的Wa病毒液，与CsCl制成56％的匀浆液，装入5 ml梯度离心管中，水平转头4 ℃ 50000 rpm，离心22 h。收集离心后形成的各区带，用TNMC缓冲液稀释10或15倍，4 ℃ 50000 rpm离心1.5 h，以去除残余CsCl。
1.2.5 SDS-PAGE检测纯化病毒蛋白 用梯度胶（8%～12%～15%分离胶，5％浓缩胶）检测纯化的病毒。取10 μl病毒液，加2.5 ml 5×变性缓冲液,100 ℃加热变性5 min，140 V恒压电泳，待溴酚蓝迁移到凝胶底部时，停止电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色。
1.2.6 Western blot检测 纯化病毒样品如1.2.5进行SDS-PAGE分离，待溴酚蓝迁移到凝胶底部时，取下凝胶，在恒流250 mA电泳1 h，将凝胶上的病毒蛋白转印到硝酸纤维膜上。硝酸纤维膜经封闭过夜，洗涤后，加入豚鼠抗RV Vp6免疫血清抗体［7］，室温作用2 h，洗膜4次。加二抗（羊抗豚鼠标记辣根过氧化酶），室温作用2 h，洗膜4次，加底物（DAB）显色。
1.2.7 病毒的感染性滴度检测 病毒的感染性滴度检测用微量滴定法在96孔细胞培养板中进行［8］：取密度梯度离心收集到的各区带病毒样品，如前用乙酶（10 μg/ml），37 ℃
孵育1 h后，用维持液行连续10倍稀释，加入已长成单层的96孔MA 104细胞板中（加前细胞用PBS洗3次），每孔100 μl,（设正常细胞对照），放5％CO2孵箱37 ℃培养，48 h后判定结果。
2 结果
2.1 密度梯度离心 经CsCl密度梯度离心后，出现3条明显的区带，各区带界限清晰。可看出，经抽提过的病毒样品的第一条带位置比未抽提过的稍偏低些，且第一条带和第二条带距离较近，但未经抽提过的第一条带中絮状物较多。
2.2 纯化病毒样品的感染性滴度测定 RV经抽提和未抽提的CsCl梯度离心后的CPE(TCID50/ml)的结果及比较，见表1。
2.3 纯化病毒样品蛋白的检测 经SDS-PAGE分离后，未经抽提过的纯化病毒样品的蛋白含量要比抽提过的高些，见图2，这可能是三氟三氯乙烷抽提过程中对病毒蛋白的损害造成的。
2.4 纯化病毒样品Western blot检测 见图略3。表1 CsCl密度梯度离心纯化的病毒样品感染性滴度 图2 纯化病毒样品SDS-PAGE检测（略）
