结果和讨论：
免疫PCR因其高灵敏度而能够检测微量蛋白，但也往往由于非特异性抗体影响而导致假阳性结果，即使用过量的BSA或牛奶封闭液、减少PCR循环次数，假阳性仍然严重。但是实验发现，使用LowCross缓冲液在不减少检测灵敏度的情况下能有效的降低非特异性反应。（图2）
第一种免疫PCR使用常规PCR反应，通过EB染色和琼脂糖凝胶电泳最低能检测300pg的SEA。（图2）
图2：SEA的免疫PCR检测：左边：没有使用LowCross缓冲；右边：使用了LowCross缓冲。这次实验中蛋白的检测下线是300pg/100ul。
进一步的实验中采用了定量PCR反应，大大提高了检测灵敏度，SEA的检测下线是 6pg/100ul，而ELISA是6ng/100ul，常规免疫PCR也只能达到300pg/100ul，并且SEA蛋白定量准确，无需PCR后处理（图3）。
图3：SEA的免疫定量PCR检测。
高分辨率熔解曲线（HRM）进行SNP基因分型
随着定量PCR仪设计上的不断改进，对温度控制的精密性越来越高，出现了像Rotor-Gene这样的管间温度均一性达±0.01℃的定量PCR仪，而该公司新近推出的Rotor-Gene6000更可达到±0.02℃的温度分辨率。温度上的高分辨率使得运用定量PCR仪进行高分辨率熔解曲线（HRM）分析基因型成为可能。高分辨率熔解曲线根据序列长度、GC含量和互补性分析样品。不同的核酸序列，哪怕仅有一个碱基的差异，也会体现在熔解温度的差别上。基因分型单核苷酸多态性（SNP）是最典型的应用，相比其它方法节约了探针和标记的费用，仅需监测模板熔解温度的不同即可对不同的样品进行分型。当然，要达到如此高的分辨率，定量PCR仪必需具备高强度的光源、高速的数据采集、精确的温度控制和极佳的温度分辨能力。除此之外，第二代的dsDNA内掺式染料，如LCGreen™为高分辨率熔解曲线（HRM）分析创造了新的机会，在反应中可以使用更高浓度的染料，使之达到饱和而不用担心对PCR反应的抑制作用。它在DNA结合（退火）、分离（熔解）及杂合子构成分析中有着空前的表现。两者结合在一起，现在我们就可以在一台定量PCR仪上实现HRM功能了。Corbett公司的Rotor-Gene6000是第一台同时具备温度循环和HRM功能的仪器。具备了定量扩增和高分辨率熔解曲线功能后，HRM分析无需再与PCR扩增分步进行，用户无需购置专门的HRM仪器，无需使用专门的毛细管，即可在一台机器上实现HRM分析。
下图就是在Rotor-Gene6000上用HRM做SNP分型的例子：
用内掺式染料（无探针）区分ACTIN3（R577X）SNP基因型（C到T替代）。野生型、突变型及杂合型如图所示（10次重复），由随机软件自动分型。图A为标准的标准化熔解曲线，B为以杂合样本标准化的差异制图。片段预先进行40个循环的快速扩增（<40分钟）。
