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实时荧光定量PCR技术:定量分析功能及软件应用
作者:未知 来源:基因公司 时间:2007-8-1

    利用定量技术进行基因型分析研究:
    常用的分析方法有两种,一种是Taqman探针法,一种为FRET探针法(又称Hyb探针),运用以上两种方法进行基因型的分析需要一台有多通道的荧光定量PCR仪。Taqman探针分析基因型是以扩增信号的有无来判定,而FRET探针则根据扩增后片段熔解温度的不同来判定。
    以下为用Taqman探针判断基因型的实例:

    这里,突变型的探针以FAM荧光素标记,野生型的探针以VIC荧光素标记,检测时分别同时检测了FAM通道和VIC通道的荧光情况。这里,3、4号样品只在FAM通道有信号,而在VIC通道里无信号,表明这两个样品为突变型;1、2号样品在FAM通道无信号,在VIC通道有信号,表明这两个样品为野生型;而5、6号样品在两个通道都有信号,但荧光强度恰为其它样品的一半,说明这两个样品为杂合型。
    并且,我们可以在软件里将不同的通道定义为不同的基因型,软件会根据不同样品在各个通道的荧光情况,自动对各个样品的基因型做出判定。


    以下为用FRET方法分析基因型的实例:

    如上图,荧光探针与突变型完全匹配,而与野生型存在一个碱基的错配,因而打开这两组双链所需的能量就不同,具体体现在熔解温度的差异上,因而突变型的样本有较高的熔解温度,而野生型的样品熔解温度相对较低。在图中,5号样本熔解温度较低,为野生型;2号样本熔解温度较高,为突变型;而1、3、4号样品在高温和低温处都出现了熔解峰,则它们为杂合型。并且用户还可以将不同的峰定义为不同的基因型,软件可根据用户的定义自动给出未知样品的基因型。如上图表格中所示。

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