利用RNA沉默技术已经成功的进行了多种作物不同方面的品质改良。应用RNA沉默技术进行22kDa玉米贮存蛋白(一个赖氨酸含量低的蛋白)的敲除得到了一个显性的高赖氨酸含量突变株[34]。传统育种也曾得到一个隐性高赖氨酸含量的突变株,该突变株所突变的O2基因是一个玉米亮氨酸拉链调控因子,控制包括22kDa蛋白的一系列贮存蛋白的表达。尽管该突变株是富含赖氨酸的,但因为种子质量和产量的下降使该突变株在农业中应用价值并不大。相反,对于玉米低赖氨酸的22kDa贮存蛋白进行RNA沉默并没有改变O2的功能,但产生了高质量的富含赖氨酸的种子。Liu等[35]利用RNA沉默技术进行了棉籽油成份的改良研究,通过抑制2个脂肪酸去饱和酶关键基因Δ92去饱和酶编码基因ghFAD21和ω62去饱和酶编码基因ghFAD221的表达,分别将硬脂酸含量从非转基因的2%~3%提高到40%,油酸含量从15%提高到77%,并表明通过上述后代的杂交可获得同时提高硬脂酸和油酸的植株,而且基因沉默程度没有降低。进一步显示出RNA沉默在农作物改良方面应用的优越性。李加瑞等[36]利用RNA沉默技术进行小麦淀粉品质改良的研究,将颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-boundstarchsynthaseI,WAXY)基因沉默,得到了直链淀粉含量明显下降的植株。供试小麦品种扬麦10号广泛应用于生产实践,使得沉默植株有潜在的应用价值。Ogita等[37]利用RNA沉默技术抑制咖啡植物中编码可可碱合成酶(CaMXMT1)基因的表达,转基因植物中可可碱含量下降了30%~80%,咖啡因含量下降50%~70%,这将使咖啡因对敏感人群的刺激降低,使引发心悸、高血压、失眠等症状减少。可以预见,RNA沉默在植物品质改良上将会有更广泛的应用。
3.3利用RNA沉默产生抗病毒植物
将病毒的某一序列设计成双链结构导入植物体使之表达,可诱发RNA沉默强化植物体内天然的RNA沉默抗病毒能力,这使得高抗病毒性的转基因植物的获得成为可能。Waterhouse等[38]利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建IRS载体进行烟草转化,获得抗性植株。Wang等[39]利用含有大麦黄矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus,BYDV)PAV株系的复制酶基因片断构建成可产生发夹式RNA结构的载体,并将该载体导入大麦得到强抗性植株并得到稳定遗传。Kalantids等[40]在转黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)cDNA反向重复序列的再生烟草植株中检测到一个完全抗性的株系,并且证实烟草病毒抗性直接与siRNA的产生相关。同时接种病毒的转化植物体表现出敏感型、恢复型(表现症状但新长出的叶片无症状)、完全抗性3种表型。其中的敏感型尽管对病毒敏感,但症状要比对照轻得多。这三种表型除了说明RNA沉默信号在植物体内可以扩散产生系统性沉默外,还说明利用RNA沉默手段获得的抗性植株的抗性强度大小并不完全一致。
在RNA沉默抗病毒的方法研究上,Tenllado等[41]观察了以直接注射和农杆菌介导转化两种方式将病毒dsRNA导入植物叶片细胞后的结果发现,两种方式都成功阻止了烟草蚀刻病毒(Tobaccoetchvirus,TEV)、辣椒轻斑驳病毒(Peppermildmottlevirus,PMMoV)和苜蓿花叶病毒(Alfalfamosaicvirus,AMV)的侵染过程。同时他们还将用于直接注射的dsRNA进行稀释处理发现dsRNA诱导的植物病毒抗性是dsRNA剂量依赖的,这与在动物上得出的结论一致。而Pandolfini等[42]的实验结果表明,即使导入烟草的李痘病毒(Plumpoxvirus,PPV)基因组片断含有可剪切的内含子序列,在转化体中也可以检测到转化片断siRNA的存在,并表现出对PPV侵染的系统抗性。在dsRNA双螺旋区域的长短设计方面,针对糖原合成酶激酶(Glycogensynthasekinase,GSK)基因进行的RNA沉默结果表明,在19nt的基础上再增加siRNA配对区域的长度不能增强RNA沉默表现出来的干扰作用。因此,载体可以只表达21nt(19nt的双链区和3’突出的两个碱基)的siRNA来达到RNA沉默的目的。然而同一基因不同区域的siRNA产生的沉默效应可能不同,所以在实验时应该比较多个不同序列的siRNA,然后确定干扰效果最好的siRNA序列。另外,通过在siRNA的正义链3’端增加1至4个不配对的核酸,强化siRNA的双螺旋结构,可能也是提高培养细胞中RNAi活性的一种手段[43]。
3.4RNA沉默在其他方面的应用
RNA沉默在其他方面也慢慢显示出它已经成为基因操作一个强大的技术工具。在生态学研究方面,oxylinpin信号途径被认为在植物防御体系中发挥直接或间接的作用,Kessler等[44]沉默了烟草中3个在oxylinpin信号途径中起作用的酶,结果发现该烟草更易被草食动物吃掉,并且它还吸引了其他种类草食动物的进食。Steppuhn等[45]利用hpRNA载体沉默了两个pmt(genesputrescineN-methyltransferase)基因,抑制了烟碱的合成。结果发现RNA沉默植株比自然植株更易成为草食动物进食的对象,比自然植株减少3倍的叶子数量,这一研究阐明了烟碱在植物防御机制中起着重要的作用。这些研究使遗传沉默植物在自然界中生物之间的互作研究中得到应用。另外,随着相关研究的进行,利用RNA沉默进行花卉新品种的开发、对作物中过敏源的去除[46]等方面的研究也将会带来更多实际的应用。
4 前景展望
目前根据拟南芥和水稻的测序结果已得到了大量的基因序列,并利用比较基因组学的方法对其中许多基因的功能作了预测,利用RNA沉默技术对这些基因进行大规模的分析鉴定,将有可能分离出大量发育调控、逆境抗性及品质形成等方面的基因,这对于植物科学的理论研究和作物遗传改良的实践都有重要意义。另外,利用模式植物中已知功能基因的保守序列,通过PCR扩增的方法在近缘生物中得到了的大量候选基因,RNA沉默技术也为这些候选基因的鉴定提供了一条新的途径。因此有理由相信,RNA沉默技术在植物基因功能研究、生长发育和性状改良等各个领域将发挥越来越重要的作用。
参考文献(略)
