hpRNA载体设计过程中,靶基因反向重复片段的长度和位置将影响基因沉默的效率。植物中一般采用几百bp的靶基因片段构建载体,Matzke等采用大约300bp的Nos启动子序列反向重复形成的dsRNA与273bp的环就足以诱导产生有效的RNA沉默。Chuang等[23]采用288~409bp的序列片段,也获得良好的抑制基因表达效果。一般认为靶基因序列应选择基因编码区片段,但Stoutjesdijk等[22]采用FAD2基因的5′UTR片段也有效地沉默了该基因。Brummell等[24]将农杆菌的3’UTR序列的反向重复片段连接于多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因片段用于番茄转化,91%的植株表现出PG基因抑制现象,成熟果实中PG的mRNA含量降低98%以上。
早先设计的RNA沉默载体一般选用强的组成型启动子如35SCaMV启动子(对于双子叶植物)或玉米ubiquitin1启动子(对于单子叶植物)启动dsRNA或ihpRNA的表达。当对目的基因的沉默表现出致死性状时,则需要构建诱导型的基因沉默载体。在植物诱导型表达系统中,几个由化学物质(四环素、铜、乙醇和类固醇等)响应的载体已被报道,其中一个比较有效的启动子系统是基于菌类Aspergillusnidulans的alc基因开关。它是由乙醇诱导的,当存在乙醇时AlcR结合到修饰的alcA启动子区域并使沉默区段得到表达,除去乙醇则表达被终止。研究证明alc沉默系统在拟南芥、烟草、马铃薯块茎中均有较高的效率[25]。然而应用化学物质作为诱导剂可能产生生长扰乱,例如糖皮质激素诱导系统就可能扰乱植物的正常生理活动。对拟南芥HSP18基因的研究[26]发现在植物中它可以作为一个有效的热激诱导系统,Masclaux等[27]应用来自拟南芥的HSP18启动子构建了几个热激诱导的基因沉默系统。与组成型CaMV35S启动子构建的基因沉默系统相比,该系统成功的沉默了内源PDS基因并表现出热诱导的特性,为其应用打下了基础。
3 RNA沉默在植物中的应用领域
3.1RNA沉默在植物功能基因组研究中的应用
后基因组时代的重要挑战是揭示基因组中所有基因的功能。分子生物学研究中经常采用减少或失活基因表达,通过对表型的观察来确定基因的功能。插入突变在这种研究中是一个非常有用的工具。两种插入突变的策略,T-DNA和转座子标签,已经在拟南芥中取得大规模应用并以此产生了几个大的公共拟南芥插入突变体库。尽管这些突变体库提供了非常好的研究材料,但通过这些方法得到的插入突变有几个缺点,如不能应用于多拷贝基因的研究、对基础调控基因的插入可能产生致死型突变、插入位点随机因此不能针对某一特定基因进行突变。RNA沉默技术则在很大程度上克服了这些缺点[12]。由于RNA沉默是一个同源序列依赖性的过程,对于目标序列的细心筛选能保证基因家族的个别基因被沉默,或者通过设计高度保守序列部分使基因家族的多个成员被沉默。RNA沉默还可以被用来对管家基因进行研究,利用诱导型启动子构建的RNA沉默系统或者对植物进行瞬时RNA沉默可以使管家基因的沉默发生在特定生长阶段或组织器官内[28]。
RNA沉默在线虫中已经有了非常有效地针对功能基因组的应用[29],植物RNA沉默技术的发展为高通量植物基因功能的揭示提供了条件。Chuang等在花发育研究中采用RNA沉默技术验证了AG、CLV3、APl、PAN等已知功能基因,并开创了RNA沉默技术在植物功能基因组学中的应用。Lu等[30]也在烟草由Pto引起的抗性研究中,利用RNA沉默随机从5000个烟草cDNA中分析其功能。Byzova等[31]利用hpRNA介导的基因沉默技术抑制拟南芥和甘蓝型油菜的花发育相关基因的表达,获得花冠发育为萼片的拟南芥和萼片状花冠的油菜,并且这些性状能够稳定遗传。最近,Miki等[4]利用水稻OsRac基因家族保守性序列设计RNA沉默载体,成功的对OsRac基因家族进行了沉默,发现该突变株系生长状况和植株高度均比正常的要差,揭示该基因家族在生长发育过程中有重要的作用。
为适应高通量基因功能研究的需要,高效沉默载体的构建是研究的热点。其中pHELLSGATE高通量基因沉默载体和一个烟草的高通量VIGS载体都利用了Gateway重组技术来取代传统的耗时、繁琐、低效的以限制性内切酶为基础的克隆步骤。Gateway系统的被应用在由拟南芥基因组RNAi敲除系列株分析协会来构建一个以pHELLSGATE为基础的载体pAGRIKOLA以产生所有拟南芥基因的ihpRNA结构,并构建RNA沉默的拟南芥植株通过表型来确定基因功能[32]。对于管家基因和表达调控因子的基因他们还计划利用诱导型启动子来构建RNA沉默植株,这些材料无疑将给拟南芥功能基因组研究带来不可取代的资源。
3.2RNA沉默在作物品质改良中的应用
尽管产量问题在传统育种和植物遗传工程研究中是最重要的目标,改善植物营养价值方面也越来越受到重视。常规育种方法在改善食物营养方面取得了卓有成效的成功,然而操作耗时,并且对于作物性状的改良只限于已经得到的突变体材料。而利用RNA沉默技术,其优越性不仅表现在可操作基因的范围和突变的种类扩大了,而且对目的基因的表达有了可控性[33]。
