1.4RNA沉默与RNA介导DNA甲基化
植物中,dsRNA不仅诱导RNA沉默的产生,而且还可以诱导产生序列特异性的DNA甲基化(RNA-directedDNAmethylation,RdDM)。针对启动子区域设计的dsRNA产生了启动子甲基化,这导致染色体构象的变化并影响了转录因子结合启动子的能力使转录效率降低。dsRNA被降解为长约23nt的siRNA揭示了它进入了一条跟PTGS中的dsRNA同样的途径[8,9]。RdDM是一个非常特殊的过程,甲基化主要局限于RNA-DNA序列相同的部分,很少向临近序列扩散,这一种显著的特异性揭示了RNA-DNA碱基配对为甲基化提供了基础。RdDM也是一个精细的过程,能够使DNA产生甲基化的RNA长度约为30nt。RdDM产生了一个不寻常的甲基化模式:在保守的CG区和其他序列胞嘧啶也被甲基化[10]。
2 RNA沉默在植物中应用的方法
目前RNA沉默的应用在动植物中采用的方法差异较大,在动物中由于长链的dsRNA诱导PKR途径非特异性降解dsRNA[11],因此动物研究一般采用siRNA的方式产生基因沉默;而在植物中由于细胞壁的限制,使注射、饲喂等方法将siRNA导入植物细胞内非常困难,因此植物中普遍采取dsRNA的方式产生RNA沉默。常用的RNA沉默技术按引起RNA沉默持续时间的不同可分为瞬时性的RNA沉默和持久的RNA沉默[12]。
2.1瞬时性的RNA沉默
导致产生瞬时性RNA沉默的方法包括基因枪轰击法和病毒侵染法。基因枪轰击法是利用金弹或钨弹颗粒包裹设计好的DNA或载体来轰击目标植物组织获得RNA沉默的方法,尽管基因枪法也能产生持久性的转基因效应,但在RNA沉默中它更多的应用于瞬时性的RNA沉默研究。用该方法对植物的转化速度快,并且当DNA进入目标组织后就会被释放并迅速表达dsRNA而产生RNA沉默现象。Schweizer等[13]通过基因枪轰击谷物如小麦、玉米和大麦的叶片表皮细胞将表达dsRNA或hpRNA的DNA结构转化入植物并引发RNA沉默,这种方法已经在沉默内源基因A1、MLO、GUS基因中得到证实,表现为目标基因活性的降低。Klahre等[14]发现通过用携带dsRNA、siRNA和一个表达单链GFP基因RNA的质粒载体的微弹颗粒轰击转GFP基因烟草能够沉默GFP基因的表达。在转GUS基因烟草中通过基因枪介导的dsRNA、siRNA和正义、反义RNA轰击以使GUS抑制蛋白沉默,发现每种方法都能产生siRNA而导致GUS抑制蛋白的沉默,结果使GUS能正常表达。
病毒诱导的基因沉默(virusinducedgenesilencing,VIGS)是通过改造侵染植物的病毒使其携带用于产生RNA沉默的DNA序列,当用该病毒侵染植物时则产生RNA沉默现象。Kumagal等[15]将人工构建的植物基因PDS的片段插入烟草花叶病毒基因组中使其产生包含正向或反向PDS序列片段的RNA时产生了光褪色现象,揭示内源的PDS基因被沉默。利用马铃薯X病毒[16]和烟草rattle病毒[17]发展了一种高效、精确的病毒诱导的基因沉默系统。尽管很多病毒诱导的基因沉默系统往往利用RNA病毒,但许多通过在终止子处发生通读而表达dsRNA的DNA病毒也被开发并被证明能够有效地产生RNA沉默现象[18,19]。
通常进行VIGS时利用目的基因的300~800bp片段可达到很好的沉默效果,但片段长度在23~60bp时也被证实是有效的[20]。利用不同的VIGS载体对于报告基因GUS或GFP或内源的PDS基因都得到很好的沉默效果。而利用TRV-VIGS载体报道了大量内源基因的沉默,尤其在抗病性和乙烯信号途径中的发挥作用的基因。并且TRV病毒对几乎所有的植物组织具有较好的侵染能力,这些因素使TRV-VIGS载体拥有更大的潜在发展空间[21]。
2.2持久性的RNA沉默
目前,在植物中持久表达RNA沉默通常采用构建表达载体,通过PEG介导、电穿孔介导、农杆菌侵染等方法使设计的序列整合到植物基因组中并稳定表达。由于农杆菌侵染法技术的成熟,在持久性的RNA沉默研究中得到了广泛应用。对于RNA沉默的持久性,Stoutjesdijk等[22]报道拟南芥中到T5代时RNA沉默仍然是遗传稳定性的。构建hpRNA高效表达载体用于特定基因沉默是研究的热点之一。Wesley等[6]系统研究了不同结构的RNA对沉默效率的影响,发现相比于单链正义或反义RNA,双链RNA尤其是发夹式结构的RNA(hpRNA)对RNA沉默的效率有非常显著的提高。如果在发夹结构的反向重复序列间加入一段非编码序列如内含子,在植物体内转录形成含内含子的发卡结构(intronsplicinghpRNA,ihpRNA),则沉默效果与hpRNA相比可从58%提高到90%。
