AA-N19 设计原则: 从启动序列下游75 个碱基开始寻找第一个AA 序列, 确定AA 序列之后的19 个碱基序列为目的序列; 计算AA2N19221 序列中的G/ C 含量比值, G/ C 含量应该在30 %～70 %之间, 最好为50 %. 如果在此序列中G/ C 含量不能达到要求, 继续寻找下一个AA 序列, 直到获得满意结果. 在GenBank 表达序列标签( EST) 数据库中用BLAST 检索, 确认所设计siRNA 序列的唯一性. 如果未达到要求, 重新设计.
按照Tuschl 等设计原则[5 ] , AA (N19) TT 模式是最理想的siRNA 序列, 如果靶点基因序列中没有理想中序列, AA (N21) 或CA (N21) 序列模式可以作为siRNA 替代序列, 由于双链siRNA中的正义链并不参与靶点序列的识别, 所以正义链的设计可以用dTdT 替代.已经有多个实验室按照Tuschl 等设计原则,设计的siRNA 取得了很好的RNAi 效果. 但是从多个方面反馈的信息表明, siRNA 的设计并不一定要严格遵守AA 序列起始原则. QIAGEN 公司根据现有的研究结果和客户的反馈意见, 对Tuschl的AA 原则进行了修订和补充. 认为mRNA 21 个碱基中G/ C 含量应为50 % , 这比确定AA 起始序列更重要. 另外序列中应该避免连续同时出现3 个鸟嘌呤碱基对, 多个G 序列重叠形成的多聚体将大大减弱siRNA 的阻断作用. 以下是QIAGEN 公司的siRNA 设计原则. 第一, 在mRNA 编码区选择21 个或23 个碱基序列, 序列中GC 含量比值尽量接近50 %. 理想的GC 含量比值为45 %～55 % ,上限60 % , 超过70 %作用明显减弱. 50～100 nt的AU G启动子和50～100 nt 的终止子区域应该避免. 第二, 在一排序列中避免出现3 个以上的鸟嘌呤. Poly G 序列可以重叠, 因此形成块状结构,严重影响siRNA 的作用效果. 第三, 优先选择AA起始序列. 如果选择AA 起始, 对应的siRNA 3′端碱基突出可以为dTdT , 从RNA 合成的角度来讲,可以大大降低RNA 合成成本和增加siRNA 对核苷酸酶的抵抗性. 如果难以发现AA 起始序列和满足第一、第二条原则, 选择另外23 nt 编码区域, 继续按第一和第二条原则重新选择. 第四, 确保所选靶序列与其他基因序列没有同源性. 在GenBank中用BLAST 软件查对, 确保靶序列的唯一性. 根据客户的反馈意见, 正义链3′端的标记不影响siRNA 的效果. 依照上述原则设计的siRNA , 80 %有效. 为了确保满意的RNAi 实验效果, 建议设计2 条以上不同序列的siRNA. 上述的设计没有考虑mRNA 的二级结构. 研究表明[6 ] , 相对于反义RNA 和核酶技术, mRNA 二级结构对siRNA 的作用没有明显的影响.
体外合成的siRNA 必需导入细胞内才能诱导RNAi , 因此, 如何有效地导入siRNA , 成为研究热点之一. 研究表明, 以往在基因治疗中使用的载体可用于某些siRNA 的导入[7 ] , 目前使用最多的是阳离子脂质体载体.
2.2 细胞内合成siRNA
由于体外合成siRNA 在细胞内的作用, 受到转染技术和效率的影响, 另外体外合成siRNA 成本较高, 体内表达短暂. 因此研究者一直在寻找哺乳动物体内表达siRNA 的方法, 拓宽RNAi 技术的应用范围. 研究表明, 在体外构建siRNA 表达载体, 通过启动子诱导表达, 在细胞内产生siRNA , 触发RNAi , 是一个切实可行的方案(图2) [8～10 ] . Brummelkamp 等[11 ] 采用RNA 聚合酶ⅢH12RNA 作为启动子, 用pSUPER 质粒作为表达载体, 以DNA 为模板在哺乳动物细胞内合成siRNA , 在10 多种细胞中取得满意的抑制特异基因表达效果, 并且在细胞中表达时间长, 对细胞无毒性. 设计插入序列时, 环路结构(loops) 的大小和序列至关重要, 直接影响所得siRNA 的抑制效果. 在机制方面, 认为首先由DNA 模板产生一个stem2loop 前体, 在细胞中切割后, 变成具有功能的siRNA. 作者认为该技术是高通量筛选基因功能缺失表型的有效方法. 同样, Paddison 等[9 ]用发夹RNAs 也取得了成功. 将siRNA 序列的DNA 模板插入RNA 聚合酶Ⅲ (pol Ⅲ) 的转录单位(基于核RNA U6 或人类RNase P RNA H1 转录单位序列) .
因此利用表达载体在哺乳动物细胞内合成siRNA 是体外合成siRNA 有效的替代方案, 具有表达时间长、作用持久和成本低等特点, 更接近生物体产生RNAi 现象的自然机制, 是未来RNAi 研究的方向.
