1） 瘤细胞培养（无特殊要求）
骨髓瘤细胞呈悬浮或轻微附着形式生长，如附着性生长的细胞多时，用吸管轻轻吹打或轻轻叩击培养容器即可分离下来。通常要维持细胞于指数生长期（细胞培养时间为15~20小时），每3~5天取细胞0.2~1ml移入到10ml新培养液中，其最大细胞密度不能超过5×105~106/ml。一般使用含有高糖的DMEM培养液，并补加有pH的稳定剂HEPES。
2）免疫小鼠和脾细胞的制备
免疫：取6~8周龄Balb/C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，3~5天后用于融合。
脾细胞制备：
1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。
2．无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次。
3．把脾脏置于已消毒的90~100目不锈钢网或尼龙纱网中。
4．在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3 ml无血清培养液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可。
5．把细胞悬液注入50ml离心管中，加10~20ml培养液，轻轻吹打数次，室温中置5分钟。
6．离心（800~1000转/分）计数，备用。
3）饲细胞的制备：常用小鼠胸腺细胞或小鼠的腹腔细胞
小鼠腹腔细胞制备方法：
1．引颈处死小鼠，用酒精消毒表体。
2．切开腹部皮肤剥向两侧，暴露出腹壁。
3．用无菌7号针头注射器，吸取3ml无血清培养液。
4．用小镊夹起腹壁，注入3ml无血清培养液，用手反复轻轻揉腹壁，再反复抽吸3~5次。
5．收集末次吸得的细胞，注入50ml的离心管中，再加20ml无血清培养液，用吸管漂洗一次。
6．离心，去上清，用含血清培养基调节细胞浓度为2×105/ml，接种入培养板中，24孔板每孔加0.1ml。
4）细胞融合
HAT培养基的制备
[贮备液成分]100×
次黄嘌呤（Hypoxanthine: H） 1.0×10-2 M
胸腺嘧啶核苷（Thymidine: T） 1.6×10-3 M
氨基喋呤（Amiropterin: A） 4.0×10-5 M
[HT贮备液制备]
1．称取136.1 mg H，38.8 mg T。
2．依次溶解在100ml双蒸水中，H难溶，可加温50~80℃促溶。
3．用0.22微米滤膜滤过除菌，每瓶分装2~5ml，-20℃冰箱贮存。
[A贮备液制备]
1．称取17.6mg A到90ml双蒸水中。
2．滴加1M NaOH溶液并不断摇动，直至完全溶解，再滴加等量1M HCl溶液，恢复pH在7.0左右。
3．补足双蒸水至最终体积100ml。
4．0.22微米滤膜滤过除菌，分装，-20℃冰箱贮存。使用时，每100ml培养液（含血清）加1ml HT贮备液和1ml A贮备液。
PEG（诱导剂）的制备（30%~50%）
1．取分子量1000的PEG高压蒸气灭菌（6.8公斤，15分钟）
2．56℃水浴中融化后，37℃水浴中温浴。
3．取无血清培养液37℃水浴中温浴（单独）
4．配40%浓度时，用刻度吸管吸0.4ml PEG和0.6ml无血清培养液混合、37℃水中温育备用。
细胞准备
1．收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次（37℃），计数活力细胞（不少于90%）。
2．收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次（37℃），并计细胞数和测定活力细胞。
3．按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。
