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分子标记技术在中药品种鉴别中的应用
作者:未知 来源:生物秀 时间:2007-7-23

      日本东京大学Ozeki等[18]分离人参属3种植物人参、西洋参和竹节参以及两种人参制剂高丽红参袋泡茶和OTANECHAN(日本1种人参组织培养物制成的茶)基因组DNA,通过RAPD分析,结果发现人参的新鲜根毛组织和干燥药材产生相同的RAPD指纹图形;人参、竹节参和西洋参之间采用不同的引物产生不同的RAPD指纹图;高丽红参茶中几乎没有DNA片断的扩增(系其提取物无模板DNA之故),但从OTANECHAN中扩增到了与人参愈伤组织相同RAPD指纹的DNA片断。这表明RAPD标记不仅可以用于人参与其它药材的鉴别,而且可以鉴定某些人参制剂中的药材品种。
      山崎真已等[19]报告采用RAPDRFLP两种分子标记方法分析了4种甘草属植物光果甘草(Glycyrrhiza glabra)、甘草(G. uralensis)、刺甘草(G. echinata)和刺果甘草(G. pallidiflora)的遗传关系。通过OPD-2OPF-2引物扩增的RAPD指纹图谱以及用Bam HIDra IEco O109IHin fINco I酶解后与水稻rDNA基因pRR217进行分子杂交的RFLP指纹图谱分析并作亲缘关系树,结果发现富含甘草甜素(glycyrrhizin)的品种光果甘草和甘草之间遗传关系非常相近,这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远,与植物分类学研究相吻合。进一步对4种商品甘草包括新疆甘草、西北甘草、西伯利亚甘草和阿富汗甘草采用RAPD方法作遗传距离估算以进行药材基原鉴别,初步证实阿富汗甘草来源于光果甘草、西伯利亚甘草来源于甘草、新疆甘草和西北甘草来源于胀果甘草。同时认为它们之间遗传距离不完全为零,可能与其他地理环境或存在亚种、变种有关[20]。
      日本九州大学Nakai等[21]采用RAPD标记方法对淫羊藿属8种植物进行了DNA分析,结果发现RAPD指纹图谱较易区别箭叶淫羊藿(Epimedium. sagittatum)和其它7种淫羊藿。
      中国中医研究院中药研究所曹晖等[2223]采用CTAB微量提取法分离菊科地胆草属2种植物地胆草(Elephantopus scaber)、白花地胆草(E. mollis)和假地胆草属1种植物假地胆草(Pseudo-elephantopus spicatus)以及4种商品苦地胆药材的基因组DNA,利用18个~24个碱基的6种引物(M 13 forwardM 13 reverseGal KSeq 2P 4SH 1133)进行AP-PCR和用10个碱基的OPC-6引物进行RAPD扩增,获得清晰可靠的DNA指纹图谱,根据这些指纹图谱的差异可鉴别出地胆草及其混淆品白花地胆草和假地胆草。同时进行DNA指纹图谱的相似度指数值测定计算分析,证实从福建厦门、台湾高雄、香港和澳门获得的商品药材苦地胆、地胆头、土公英、小本灯竖圬的基原为地胆草。
      我国南方部分省区有多种菊科不同属的植物如地胆草、一点红Emilia sonchifolia、苦荬菜(Paraixeris denticulata)、毛大丁草(Piloselloides hirsuta)、山莴苣(Pterocypsela indica)、苦苣菜(Sonchus arvensis)土公英之名混作蒲公英(Taraxacum mongolicum)使用。曹晖等[2425]利用AP-PCRRAPD分子标记方法对蒲公英及其6种土公英混淆品进行了DNA指纹鉴别研究,结果显示它们的DNA指纹图谱存在明显的差异,利用这种差异可从分子水平上鉴别蒲公英及其混淆品。
      成都军区昆明总医院张荣等[26]用RAPD方法对铁线莲属7种生药山棉花(Clematis chrysocoma)、三叶五香血藤(C. fasciculifolia)、小九头狮子草(C. ranunculoides)、小木通(C. armandii)、红叶铁线莲(C. rubifolia)、红钉耙藤(C. brevicaudata)和铁线莲(C. florida)进行了鉴别,结果表明RAPD指纹图谱中种间差异明显而同种不同产地差异不明显。用同样的RAPD分析法对木蓝属8种生药蒙自木蓝(Indigoferae mentzeana)、鸡眼草(I. striata)、苍蝇草(I. hancockii)、山皮条(I. szechuenensis)、小苦参(I. sensitiva)、野青树(I. suffruticosa)、尾叶木蓝(I. caudata)、昆明木蓝(I. mairei)也进行了鉴别研究,结果表明RAPD分析法是一种有效的中药鉴定方法[27]。
      日本广岛大学Kohjyouma等[28]对日本野生或栽培的茅苍术及其变种(A. lancea var. simplicifolia)、北苍术、关苍术和白术采用GCRAPD方法分析它们的挥发油组成和亲缘关系,结果表明苍术酮(atractylon)不仅在关苍术和白术(日本作白术用)中存在,而且在茅苍术及其变种(日本作苍术用)中亦有发现,RAPD谱带证明了茅苍术存在种内变异,这与水上元等人采用RFLP分析的结果完全一致[7]。
      蛇类药材如乌梢蛇(Zaocys dhumnades)和金钱白花蛇(Bungarus multicinctus)市场上出现6种混淆品种和伪品,仅靠其外部形态和骨骼、鳞片特征难以鉴别。南京师范大学王义权等[29]成功地利用RAPD方法准确地检出乌梢蛇和金钱白花蛇的混淆品和伪品。
      对不同产地(中国、美国、加拿大)西洋参和不同来源(厦门、高雄、香港、澳门)苦地胆由AP-PCRRAPD产生的同一品种DNA指纹图谱几乎一致[172226],由此说明PCR方法在中药品种鉴别上的稳定性和重现性。无论是RAPDAP-PCR本质上都是任意引物的随机扩增,只是引物的碱基长度不同而已。RAPD标记所需样品基因组DNA的量仅为10 ng,是AP-PCR标记十分之一左右,且RAPD引物已可商品化生产。因此,它可以在不知道特异DNA序列的情况下检测DNA的多态性,尤其在目前绝大多动、植物中药材DNA序列尚不清楚的情况下,在中药品种研究方面RAPD标记比其它分子标记更具有广阔的应用前景。

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