现代分子生物学研究发现,中药材(不含矿物药)所依赖的生物资源——“物种”的多样性是由于其基因多态性的结果,而基因多态性可在分子水平上检测,它比在形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异类型的遗传标记。传统的分子标记主要有血清学特征、蛋白质谱、同工酶谱,近10年来则有迅速发展起来的DNA分子标记,现介绍如下。
1 传统的分子标记
1.1 抗血清 中药有许多具有抗原决定簇结构的大分子如多糖、蛋白质等,用它们制成特异性抗体(抗血清)进行中药定性定量分析是一种高度选择性的血清学检定方法,血清学特征对中药复方制剂(成药)中特定的药材(如动物药)鉴定上具有极大的开发利用价值。有人报告,采用免疫化学方法鉴别虎骨、豹骨[1~2]。又如有研究报告采用酶联免疫法(ELISA)确证出长牡蛎(Ostrea gigas)特征蛋白抗原,制备免疫抗血清成功地对中药复方制剂海王金牡蛎制剂(胶囊)中的药材牡蛎进行了鉴别和含量测定[3]。其缺点是免疫测定试验周期长,所需动物量大等。
1.2 蛋白质 采用凝胶电泳技术进行蛋白质谱带数目、宽窄、位置、以及染色程度分析,可获得很多信息,从而达到中药鉴别的目的。如人参(Panax ginseng)和西洋参(Panax quinquefolius)及其5种伪品沙参、蔓生百部、桔梗、紫茉莉、商陆通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱可以达到鉴别目的[4]。但是蛋白质电泳图谱类型主要是依靠肉眼直观比较,人为区分的,在一定的程度上影响了结果的准确性。
1.3 同工酶 特点是同工酶的变异非常丰富,结构的差异直接来源于基因的差异,并能够稳定遗传。因此,用它可以鉴别许多从外部形态上难以区分的遗传变异。其次,由于同工酶分析系采用酶活性染色和电泳检测,非酶类成分不被显示,电泳图谱往往比蛋白质电泳图谱简洁、清晰。缺点则是为防止酶失活,条件比蛋白质分析要求高。取样必须是新陈代谢活跃的部位,这也限制了同工酶分析方法在干燥药材鉴别上的应用。在中药鉴别方面,已有人参与西洋参的过氧化酶(POD)和酯酶(ES)的同工酶酶谱鉴定分析的报告[5]。
2 DNA分子标记
因为上述传统分子标记存在一定的局限性和应用范围,DNA分子标记技术的发展使中药的分子鉴别成为可能。在DNA分子水平,限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)被称为检测基因多态性的常规技术。而其中建立在PCR技术基础上的DNA指纹图谱法(DNA fingerprinting)和DNA测序法(DNA sequencing)则是90年代才发展起来的分子标记。
利用PCR从不同生物样品中人工合成DNA片段,而这种DNA片段的大小、数目可因不同的生物而异,故称之为“DNA指纹图谱”。这种DNA指纹技术具有重复性好、灵敏度高的优点。由于DNA分子标记直接分析的是生物的基因型而非表现型,所以鉴别结果不受环境因素、样品形态(原品、粉状或片状)和材料来源的影响,因此,可为中药品种鉴别提供更加准确可靠的手段。
2.1 RFLP标记 80年代中期才发展起来的DNA片断分析技术RFLP不仅在生物学、医学、农学的许多领域都有了成功的应用,而且在中药材品种基原及其地理品系、栽培品系系的质量评价方面也已有了许多研究报道。
《日本药局方》收载的三岛柴胡(Bupleurum falcatum)是以日本九州为主要栽培地,但其为地理多样性品种。根据产地不同,叶序、染色体数目、皂苷含量均存在明显的差异。日本名古屋市立大学水上元研究小组对日本8个产地野生的柴胡采用水稻rDNA作探针,用限制性核酸内切酶Dra I,Kpn I,Taq I 酶解进行RFLP分析,结果发现秋吉台、平尾台、香春、汤布院为代表的山口*北九州地理品系的RFLP与其它品系明显不同,这与形态学、细胞学、化学的研究结果相吻合[6]。
对茅苍术(Atractylodes lancea)、北苍术(A. chinensis)、关苍术(A. japonica)和白术[A. ovata=A. macrocephala)(前两者日本作苍术用,后两者日本作白术用)]的挥发油化学成分分析发现,苍术类主要含苍术素(atractylodin),而白术类主含苍术酮(atractylon)。《日本药局方》以此成分的差异作为白术与苍术的理化鉴别依据。然而日本市售苍术商品药材中常含有白术的特异成分苍术酮,因此有人认为这是由于茅苍术和白术类植物杂交的结果。水上元研究了日本和中国野生或栽培的术类19个地理品系,采用Dra I,Kpn I,Eco RV,Sac I 酶解,用上述同样的RFLP方法进行分析,发现日本栽培的茅苍术与中国产的RFLP几乎一致。虽然存在含较高苍术酮的茅苍术,但RFLP未显示出茅芬术与白术或关苍术的杂交谱带,这表明茅苍术存在种内变异。同时发现这3个种之间RFLP均有明显的差异,可资区别[7]。
日本千叶大学山崎真已等[8]采用RFLP方法分析羽扇豆属(Lupinus)5种药用植物白羽扇豆(L. albus)、黄羽扇豆(L. luteus)、多叶羽扇豆(L. polyphyllus)、埃及羽扇豆(L. termis)、毛羽扇豆(L. hirsutus)的亲缘关系及与其所含双稠哌啶类生物碱的相关性,结果表明RFLP可以区别这些羽扇豆属药用植物。
目前,人们感到RFLP技术在应用上很不方便,原因是费时费力,且仅限于作探针的基因长度。同时,与同工酶标记一样,RFLP分析技术要求新鲜的材料,难适用于干燥药材的鉴别。


