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基因差异表达技术
作者:佚名 来源:生物秀 时间:2007-7-23

    六、电子消减

    电子消减是通过比较相同的基因的cDNA文库中被重复测序出现次数,可以粗略推算出该基因在不同文库中的丰度差异以达到差异显示的目的。

    七、差异显示技术衍生的方法

    (一)应用随机引物PCR的RNA指纹法

    除反转录这步是由随机oligo dT引物替代锚定oligo dT引物外,应用随机引物PCR的指纹法(RNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR, RAP-PCR)与DD-PCR基本上相同。与DD-RCR相似,RAP-PCR可以用于多个不同细胞族或不同处理后转录体之间的比较。

    (二)引物选择差异显示

    引物选择差异显示(DD-PCR with selected primers, SPR)的目的是进一步倾向于筛选低到中丰富度RNA。与RAP和DD-PCR不同,SPR实验性的选择随即引物以避免高丰富度RNA的扩增。特点有4个方面:①所设计引物因含有50%的G+C,但3′末端应不超过50%,以减少高丰度rRNA和线粒体RNA的扩增。②所有PCR循环应以较高的退火温度进行,以增加选择性和可重复性,减少所扩增条带的数目。③由于高丰度转录体有一个引物优先扩增,条带的选择将根据两个引物的扩增为依据。④由于Northern分析不能检验地丰富度的RNA,差异表达条带的鉴定将由定量PCR来确定。这些改进也在其他研究中采用。SPR这一方法的缺点是引物必须在实验中设计。然而,一旦选择了这一引物,就可以在类似实验中使用。

    (三)目标显示

    DD-PCR一个非常有用的改进是目标显示(targeted display)。它可以鉴定基因家族的成员、具有特殊区域的基因或不同条件下分离的序列图。目标显示用锚定引物进行反转录,而PCR扩增则采用与保守的蛋白区域同源的变性引物来进行。正常情况下,基因家族新成员可以通过用变性寡核苷酸率选基因文库来进行鉴定。近来,用两个变性引物进行PCR的方法也已使用。此方法的主要缺陷是:①5′段引物应具有与标定区域100%同源的序列;②引物不能过度变性,以至产生过度复杂模式;③目标区域应位于近poly A尾处。

    (四)顺序差异显示

    顺序差异显示(ordered differential display, READS)首先由Prashar和Weissman报道。其反转录由一个含有20个碱基尾端(heel)的双核苷酸oligo dT来进行,因此所有cDNA均有共同的3’端。这些产物用限制性酶消化并连接到一个Y型的连接体(adapter)。Y型的连接体有三部分组成:①与限制酶相容的3′端开口;②补充的中间体;③非补充5′。在扩增中,3′引物延伸到“跟部”,而5′端引物延伸到Y型连接体的“上肢”。但只有限制消化的cDNA的3′端在严紧条件下扩增。READS的结果依赖于消化cDNA的限制酶,因此cDNA的长度各不相同。不同细胞总RNA获得的cDNA由不同的限制酶可以系统的分切为3′端限制性片断。用限制性酶切来消化cDNA,几乎可以反映所有哺乳动物的基因组。其两次实验间的重复性很好。

    八、基因芯片技术

    生物芯片技术是在信息技术和生物技术集合在一起的产物。其中的基因芯片借助于计算机控制的机械手段对已知的众多探针按预定的位置点阵,固定在固相支持片基上,然后于标记的待测样品进行分子杂交反应,通过激光共聚焦荧光检测系统来分子每个杂交信号的有无及强弱,进而获得每个样品携带的相关信息,经专用的程序软件的分析得出最终结论。该方法可以一次对样品中的大量相关信息进行平行监测分析,解决了传统核算杂交、免疫反应的操作复杂、检测效率低既可比性不强等问题。该方法的最基本原理也是基于基因的差别表达,因现阶段常将其作为功能基因组学的研究的重要方法。

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