二、mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）
随着PCR技术的发展，人们在此基础上建立起了一系列基于基因分离的新技术新方法。如mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、以及进一步改进的代表性差示分析（RAD），抑制性扣除杂交（SSH）和交互扣除RNA差别显示技术（RSDD）。
差别显示PCR是根据绝大多数真核细胞mRNA的3′端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5′-T11MN；同时为扩增出polyA上游500 bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10 bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA类型，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。回收不同组织所特有的差别表达条带中的DNA，再扩增至所需含量，进行Southern blot或Northern blot或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因。
差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。如在1994年，Ito等对3′端锚定引物的设计由固定两个碱基变为一个碱基固定的引物，这就使原来12种引物减至3种即可（5′Ｔ12Ｇ，5′Ｔ12Ａ，5′Ｔ12Ｃ），这样做减少了每个mRNA样品对逆转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些RNA的代表性差和RNA数量过多现象降低到最低程度；在随后的两年中，研究人员有在3′端引物和5′随机引物末端分别加上了限制性内切酶识别位点（如Hind III酶切位点），使得5′端引物条数改为8条，长度为13 bp，而3′端引物则由18个碱基组成。这样形成的24种引物对，经计算机同源性分析表明同样能覆盖全部mRNA，使实验简化，同时由于引物变长，使cDNA扩增更为有效。有的实验室采用把Bakman公司的kit，其引物5′端为26 bp，3′端为31 bp，并加上了T3和T7两端的测序引物，由仪器切割差异条带后，再次扩增，并通过荧光标记，用计算机统计出结果。此外，许多学者针对该技术在操作中假阳性高等问题，还从设计对照、提取胞质RNA、更换放射性标记物以及改变PCR反应条件等等方面提出了相应解决方案，以求这一技术得到进一步完善。
mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）与示差筛选、扣除杂交相比，具有很多优点：①速度快，较易操作；②由于PCR扩增技术的应用，使得低丰度mRNA的鉴定成为可能，且灵敏度高，③可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。
尽管差别显示技术有以上诸多方面的优点，但在实际操作中仍存在一些问题，主要表现在：①出现差别条带太多，假阳性率高达70%左右，重复性差，且对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性；②扩增条带分子长度较短，一般在110-450 bp之间。
代表性差示分析，充分发挥了PCR以指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过消减和富集，使得目的基因片段得到特异性扩增。将待测cDNA（Tester）和驱动cDNA（Driver）分别用同一种经识别4碱基序列的限制性内切酶切割形成的平均长度为256 bp的cDNA片段代表群，保证了绝大多数遗传信息均能被PCR扩增；分别接上寡聚核苷酸接头（adaptor），并以接头为引物进行PCR扩增，此步将大小不等的DNA片段分离纯化；将接头切除，并只在Tester片断末端接上新接头，然后将Tester与大大过量的Driver混合杂交。Driver过量的目的是使Ｔ群体中特异性序列没有遗漏的可能；复性，补平末端，并以新接头为引物进行PCR扩增，形成的3种杂交体中只有自身退火形成的Tester/Tester两端均能和引物配对，产物双链DNA数量呈指数递增。Tester/Driver杂交体只能是单引物扩增，产物为单链DNA分子，其数量呈线性递增。Driver/ Driver杂和体由于分子两端没有与新引物配对区而无法进行扩增；用Mung Bean Nuclease去除单链DNA分子，差异双链cDNA便完成第一轮富集。实验中使用过量Driver DNA目的是充分使Tester DNA中和Driver DNA序列相同的片段杂交，酶解去除，只有差异双链差异cDNA经PCR几轮循环得以有效富集。
