外源DNA直接导入受体植物的转基因方法目前已被越来越多的研究者所采用,具体包括花粉管通道法、生殖器官/组织/细胞及种子和整株浸泡法、胚囊或子房注射法等,该方法利用活体植株或部分作为受体,不必经组织培养途径,因而避开了植物再生因难所带来的限制,该法也不受植物类型限制(朱生伟等,2000)。
2 基因受体的选择要考虑受体材料的生理状态和再生途径
原生质体脱除了细胞壁,与动物细胞的生理状态最为类似,通常具有均一的生理状态,从叶肉细胞游离到的原生质体尤其如此;原生质体作为受体获得的转基因植株通常是来自一个转化细胞,避免了嵌合体产生,而且容易对大量原生质体进行转化处理,可以获得许多转化细胞克隆;愈伤组织通常从复杂的多细胞类型的外植体上诱导产生,因而其初始生理和遗传具有不一致性,另外细胞壁的存在使得某些转化方法的应用受到限制;悬浮细胞培养(细胞团和单细胞的混合物)中,细胞团的大小及与单细胞的数量比例随基因型与细胞系的不同而存在较大差别,因而其生理状态介于原生质体培养和愈伤组织培养之间。尽管原生质体作为受体有种种优点,但由于能通过原生质体培养获得植株再生的植物不多,而且相对需要专业的技术和经验,步骤繁多,难度较大使其应用受到限制。花粉作为受体,既可经转化后授粉受精和胚胎发育形成子代转基因植株,也可转化后经体外培养而经胚胎发生途径产生单倍体植株,尔后经染色体加倍而获得纯合的二倍体转基因植株。利用花粉或小孢子作为受体可避免产生转基因植株的嵌合现象(施华中,1998)。
从受体的再生途径来看,植物组织培养中通过不定芽(或器官)发生和体细胞胚胎发生通常被认为是少数细胞和单细胞起源的,以单细胞起源的植株再生途径显然对转基因是有利的,因为这可以避免产生嵌合现象。为避免嵌合体的产生,选择受体最好不用分生组织或分生细胞预先存在的材料如茎尖、胚芽、顶芽、腋芽和花序等。但是,分生组织通常再生能力极强,尤其对于难以进行组织培养和植株再生的植物种类而言,采用分生组织或茎尖培养是可能也是一种的选择,因为转化的分生组织细胞可能经发育产生转基因的扇形区,转基因的扇形区在嵌合体上可能进而产生同质的配子并产生转基因的植株(Sautter等,1955)。另一方面,有研究表明即使茎尖培养中以丛生芽方式增殖时,仍有相当高比例的不定芽(如对草莓进行体外快速繁殖时,不定芽占到新生芽的80%)(Swartz, 1991),在较高的细胞分裂素存在下进行较快增殖并对丛生芽进行连续切割转接,有可能降低嵌合体产生的比例。
3 基因受体的选择要考虑体细胞无性系变异的发生
体细胞无性系变异(somaclonal variation)是指经组织培养再生植株表现的变异。通过对组织培养产生的植株同无性繁殖或种子繁殖植株的变异进行对比研究表明,经组织培养产生的变异要比常规繁殖方法产生的植株表现更多的变异。体细胞无性系变异的变异率可以高达30-40%,有时甚至高达100%,某一具体性状的变异率在0.2-3%之间。
从来源和机理讲,体细胞无性系变异既可能是外植体中细胞预先存在的变异的表达,也可能是在组织培养过程中诱导产生的。一般说来,除非采用单细胞或原生质体,否则,对由不同类型细胞组成的多细胞外植体进行培养会导致再生植株表型的不一致性。预先存在变异包括内复制造成的细胞间染色体倍性差异,体细胞突变及DNA甲基化状态的变化等,由不定芽再生导致的嵌合体的分离是最明显的预先存在变异的表现。培养中诱导产生的变异主要受培养类型、外植体类型(或组织来源)、培养条件、培养物的年龄、遗传组成(或基因型)及有丝分裂重组等因素的影响。一般而言,一个已分化的细胞经历变化剧烈的脱分化和再分化很容易产生变异,因而愈伤组织培养常与体细胞无性系变异联系在一起;另一方面,愈伤组织通常从切口处产生,因而与活体中的伤口反应极为类似,容易激发转座子的活动,以及胁迫刺激诱导产生某种酶类或特异性产物,因而商业微繁殖中尽量避免愈伤组织培养。体细胞无性系变异并不局限于愈伤组织培养,其它如直接不定芽发生和胚胎发生都可导致变异产生。从培养类型方面而言,不同外植体类型产生的再生植株上的体细胞无性系变异频率和性质存在差异。


