④每次反应所用引物的量。
用引物延伸实验定量RNA，标记的引物必须多于目的RNA。引物应是互补RNA的5-10倍。但一般，总RNA或poly(A)+RNA中，特定目的RNA量未知。对未分析的转录物，初次分析用50 ug总RNA和100fmol引物。如所有RNA中与引物互补的位点饱和，测试信号和投入的RNA的量成正比，而不依赖于引物的浓度。引物应至少为20个核苷酸，杂交位点应位于转录产物5`-末端下游的100个碱基处，而不会自互补。也可用从限制性酶切片段所得的ssDNA作为探针，长度应不长于50-100个核苷酸，以获得最佳分辨率。
⑤AMV和MMLV的选择。
引物延伸反应通常用AMV，AMV性能更好，对次级结构耐受。用AMV的延伸温度可达55℃, 以消除次级结构，但在这样温度下，引物延伸反应的得率通常降低。MMLV的最适温度为37℃，在更高温度下，MMLV不稳定，但MMLV可合成更长的产物，这一特点对引物延伸反应不适用，因引物延伸反应所得的产物一般较短，为100-500个核苷酸。
⑥会导致非特异，短的和多个引物延伸产物的影响因子：
所研究的转录的差异程度可导致产生不同长度的延伸产物，它们来源于选择式剪切和使用不同的转录起始位点。差异核RNA的存在也能导致产生多个延伸产物。引物和RNA中相关或无关序列的交叉杂交也会导致非特异延伸产物的产生。产物短于预测可能和RNA模板的降解有关，或者是转录产物中次级结构阻制了反转录酶的合成，产生断缺的cDNA。RNA样品中存在DNA污染同样可得延伸产物，加放线菌素D（75ug/ml）可抑制这类产物的产生。应作无RNA模板的负对照实验，以确定所用试剂中无RNA和DNA污染。同时还应用从不表达目的转录产物的细胞或组织中提取的RNA模板作负对照实验。
（4）计算RNA转化为cDNA的量。RNA转化为cDNA的量可对引物延伸产物，和`无RNA`对照实验的cpm作测量得到。从凝胶中分别切割引物延伸产物和`无RNA`对照实验中产物，在闪烁液中测定凝胶块的读数，可有效平衡聚丙烯酰胺凝胶的湮灭和32P的衰退。以下的例子表明如何计算fmol的RNA转化为cDNA，在这个例子中，一半的引物延伸产物（20ul/40ul）加入凝胶中作分析。`无RNA`对照实验的引物浓度为100 fmol，一半的反应液加入凝胶中作分析。切割的带的读数为：样品为3912 cpm，引物为142359 cpm，首先计算引物cpm/ fmol：cpm/ fmol=142359 cpm/[100 fmolX（20/40）]=2847 cpm/ fmol，接下来计算引物延伸产物的fmol，或cDNA：3912 cpm/[2847 fmolX（20/40）]=2.75 fmol cDNA。所得值表明引物延伸中所得的cDNA的量。
（5）确定引物延伸产物的精确长度的分子标准参照物。为确定引物延伸产物的精确长度，应同同位素标记的DNA分子标准参照物对照。DNA分子标准参照物末端作了标记，上变性凝胶前先作变性，引物延伸产物也作变性。长度在20-500核苷酸范围的分子标准参照物在确定引物延伸产物的长度方面很有用。去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 标准分子参照物非常方便，已去磷酸，可作5`末端标记，分子标准参照物的长度为24-726核苷酸。用于引物延伸产物分离的聚丙烯凝胶的规格为16X18cm, 含8%聚丙烯、7M尿素、1′TBE溶液。这种胶和测序胶很相似，故一般可用测序胶。应注意不使引物延伸产物和自由引物跑到胶外，特别是需对cDNA定量时。
2、核酸酶S1作图（Mapping RNA with Nuclease S1）
三种不同的核酸酶——S1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶VII被用来进行RNA定量，确定内含子位置，及鉴定在克隆的DNA模板上mRNA的5`-末端和3`-末端的位置。含有目的mRNA的RNA样品与互补的DNA或RNA探针在利于形成杂合体的条件下温育。在反应的末期，用核酸酶用来降解未杂合的单链RNA和DNA。余下的DNA-RNA或RNA-RNA杂合体用凝胶电泳分离，接着用自显影或Southern杂交来观察。当探针的摩尔数在杂交反应中过量时，信号强度与样品中目的mRNA的浓度成正比。用过量探针与一系列定量的靶序列杂交作出标准曲线，从而可准确估算样品的浓度。在真核系统中，S1核酸酶消化过的5`-末端通常代表转录起始点，而3`-末端代表聚腺苷酸化的位点。同样的策略可用来对拼接位点的5`-末端和3`-末端作图。
