2.NP40 lysis 缓冲液
1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
5MNacl 15ml (150mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
20%NP40 25ml (1%)
TLCK 18.5mg (0.1mM)
TPCK 35mg (0.2mM)
DDW 450ml
toal 500ml
使用前加1mM的PMSF
注意点：
*Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。
*反复使用PMSF要注意保管方法。
*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，，DOC<SDS是离子性的强活性剂。注意忘记加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2的作用温和，却可能造成抗原溶解不全。
*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。
Protocol
1 调制protein A sapharose
protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存
用单抗做一抗时，把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后，再离心1-2s
去上清后，加PBS，vortex混合，离心去上清，重复二次
加含0.02%NaN3的PBS到原来体积，冷存。避免长期保存。
2．抗原的检出
以下操作全在冰面或4度进行
去除细胞培养液，用冷PBS洗一次。加RIPA，溶解后，转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量：6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。
30m，15000rpm离心，上清转移到新tube 。不用移液枪，直接从tube倒进另一个tube
往上清加抗体，1ml加2-5ul抗体，冷室内旋转混匀1h
加protein A sapharose50ul，再混匀1h
5000rpm离心1s,使sapharose沉淀，去上清。往sapharose加RIPA，vortex 混匀，离心，去上清。重复4次洗净。
加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸，泳动后，固定/干燥胶，现像。
3.注意点
A：不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。
B：对电泳的非特异条带，最后可依次用含300mM，1omMNaCl的RIPA洗净各一次。
