4.引物设计
染色体显微切割引物分特异性引物和简并引物。特异性引物有外源性和内源性两种。Ludecke等将内切割片段克隆进puc载体，再用SamI酶切后puc上序列作特异性外源引物PCR扩增后将PCR产物克隆到puc13中，构建了染色体8q23-q24文库。基因定位则常用特异性内源性引物[15，16]，即基因组DNA的一段特性性序列。简并性引物以5%26acute;-CCGACTC-GAGNNNNNNATGTGG-3%26acute;(N=A,T,G,C各25%)[17]最为常用，它比六个简并核苷酸置于3%26acute;末端[18]污染少，但简并性效果差些。简并的引物可自行扩增[19]造成探针池和文库的质量下降，但由于其操作简单，免去酚仿抽提、连接等步骤，又能相对减少污染。Tokayama等采用简并寡核引物穿梭PCR（Dop-shutter-PCR）提高了探针池的特异性。
5.PCR扩增周期
PCR大大减少了切割工作量，提高了成功率，甚至一个 dNA拷贝也能扩增成功[20]。但PCR扩增周期增加会导致文库质量下降，而FISH信号不一定减弱[21]。只要有某些片段在PCR中稍易扩增，就易引起这些片段的富集，Stefank等[18]在66个克隆中发现一个克隆出现8次。然而另一些资料显示，由于简并，PCR扩增呈序列非依赖性，甚至2kbDNA模板也可扩增出不同大小的片段，在琼脂上无明显条带。
三、应用
随着生命科学领域细胞分子水平研究的深入，染色体显微切割在人、果蝇[1]、大鼠[22]、小鼠[23～25]、猪[26]等染色体研究中都有所应用，其应用价值和应用前景主要以有几个方面。
1.染色体水平的研究
应用显微切割构建的染色体特异性和染色体区带特异性探针池，与可疑患者染色体进行正向染色体涂染[27]，或直接切割标记染色体，进行反向染色体涂染，可以用于研究标记染色体[28]，单体、三体、双微体、易位、缺失[29]以及染色体均染区（HSR）的来源、结构和形成机制等。Tigand等[30]用显微切割构建的区带特异性探针池发现脊髓发育不良病人中有5q-;而Engelen等[31]发现了5个断裂点的染色体复杂重排。染色体显微切割在染色体病产前诊断[32]与产后分析中发挥了重要的作用[33]。
2.分子水平的研究
（1）构建染色体特异性和区带异性文库
染色体显微切割、PCR得到的探针长度通常为150～1500bp，一般可以用来构建质粒gDNA文库[34]。而Hozier等[35]将cDNA原位杂交与染色体显微切割结合起来，构建了鼠4号染色体C3-7区带文库。1996年 Yokoyama等[36]从胎脑mRNA反转录合成了第一链cDNA，再用两步扩增法—Dop-shutter-PCR合成短片段cDNA，杂交于包括两个近端着丝粒的K562细胞系中期分裂相，再切割标记染色体，发现81.5%克隆来源于所切割的相应区域，8个单拷贝序列中有5个是新的cDNA序列，仅1个来自于非切割区。应用显微切割所构建的探针池也可通过文库筛选快速分离区带特异性文库[37]Abdel等[38]则分离构建了包括700个Cosmid的12号染色体区带特异性Cosmid亚文库。
