湖南医科大学医学遗传国家重点实验室（长沙410078）邓 昊综述 夏家辉审校
提要 染色体显微切割技术是细胞遗传学与分子遗传学相结合的一项桥梁技术。近年来，该技术在同源基因的定位和克隆的价值深受关注。本文结合显微切割的经验，对其应用和新进展进行了综述。
关键词 染色体显微镜切割技术；同源基因；定位；克隆
完成人类基因组计划的全序列分析，需要构建基因高分辨遗传图谱和物理图谱，如何快速有效的获得染色体区带特异性的序列标签位点（STS）及表达序列标检（EST），构建克隆连锁群，分阶段有序列的完成特定区带全序列分析，染色体显微切割技术显示出无可比拟的优越性。该技术自80年代初问世以来，通过与PCR、微克隆、FISH、DNA测序、文库筛选、比较基因组杂交等分子生物学技术相结合，在染色病研究与诊断、文库构建、基因定位与克隆、以及进化遗传学与肿瘤遗传学等方面的研究中取得了令人瞩目的成绩，并以其独特的直接性和实用性保持其分子生物学领域良好的应用前景。
一、历史回顾
1981年，德国的欧洲分子生物学实验室（EMBL）Scalenghe等[1]切割了果蝇吃得开液腺多线期X染色体第3段的几个片段，通过蛋白酶消化、酚抽提、EcoRI酶切进行重组克隆。1984年染色体显微切割应用小氧，1986年Bates等[2]切割了人的2号染色体短臂。但当时由于所切割的染色体DNA量少，通常要切割上百条染色体，且其文库也只含几百个微克隆。显微切割技术的第一闪重在突破在于它与PCR的结合，1989年Ludecke等[3]切割了人类G显带染色体，结合PCR技术进行体外扩增，使其工作量大大减小。邓汉湘等[4]则创造性的设计了linker-priner粘端接头，提高了连接效率，增高了文库质量。而1992年Melter等［5］在PCR扩增过程中引入简并引物，在减少工作量的同时，还解决了探针片段受酶切位点限制、文库不全和部分序列高度富集的现象，是染色体显微切割领域的又一重大突破。
二、探针池或文库质量的控制
显微切割是一项极其精细的工作，需要有熟练的技术和严格的防尘措施。通常一个好的文库存至少覆盖50%以上所切割的染色体区域，而且不应存在一些片段在PCR过程中的高度富集，才能保证以后研究中能分离较多的特异性DNA片段。污染的来源可以从以下几个方面进行控制。
1.实验试剂和用具
实验操作台要保持相对无菌，实验操作人员要戴口罩。所用缓冲液应用0.22μM过滤器除菌，切割针对可用紫外线照射30分钟或干热灭菌。尽量使用一次性无菌用品。
2.染色体切割玻片的制备
虽然切割常规G带片段通过FISH杂交得到阳性信号，甚至使用-20℃固定3年的细胞悬液制片也可能有满意的结果[6]，但长时间的酸固定和暴露于空气中可造成克隆插入子片段子[7，8]。Hagng等[9]为减少冰醋酸固定细胞引起DNA降解而采用速固定和乙醇洗脱。
3.切割方法的选择
染色体显微切割分手工切割和激光切割法[10～13]。前者较不常用，其方法是在倒置显微镜上装配切割臂，安上硅化玻璃针，找到分散良好的分裂相来切割所需染色体片段。所切割染色体片段在油室中操作则操作繁琐，而在Eppendorf管中操作污染较多。激光切割法分三步[4]：（1）自动浇灼：常规将所切割的染色体周围核型及细胞核用激光浇灼；（2）手工浇灼：浇灼切割核型内除切割区带以外的染色体；（3）比率确定：精细切割区带边缘。激光能切割不太分散的分裂相，污染小，提高了成功率，但需要较高的设备条件，推广较困难。
