前言

Lipofectamine™ 2000试剂是一项专利配方，用于高效转染Stealth™ RNA或者短的干扰RNA（siRNA）到哺乳动物细胞，以进行RNAi分析（1，2）。该说明书提供了一般的指导以及使用Lipofectamine™ 2000转染Stealth™ RNA或者siRNAj进入哺乳动物细胞的步骤。提供推荐的起始使用试剂剂量。为了获得最佳的RNAi实验结果，需要针对哺乳动物细胞系和目的基因优化转染的条件。

影响基因阻断水平（Gene Knockdown Level）的因素

在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达程度的降低（例如：基因阻断），包括：

当设计转染和RNAi实验时，需要考虑这些因素。如果需要更多的信息帮助您成功的进行RNAi实验，查阅标题为"RNAi成功的七个步骤"的文献。随同StealthTMRNA订货可以得到说明书，也可以从我们的网站（www.invitrogen.com）下载或者通过与技术服务联系获得说明书。

转染的一般性指导

使用Lipofectamine™ 2000转染Stealth™ RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，遵从以下一般性指导：

1 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染Stealth™ RNA或者siRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine™ 2000的浓度，并在20-100nM范围内改变Stealth™ RNA或者siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的Stealth™ RNA或者siRNA可能具有细胞系依赖性。注：我们推荐开始时使用40nM Stealth™ RNA或者siRNA。

2 在30-50％细胞汇合度时进行转染。通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。低密度转染细胞可以使转染和分析之间更长的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。

3 不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。

4 为了获得更好的结果，可以使用Opti-MEM® I 低血清培养基（目录号31958-062）在形成复合物前稀释Lipofectamine™ 2000和Stealth™ RNA或者siRNA寡聚物。

5 可以使用invitrogen BLOCK-iT™荧光寡聚物(BLOCK-iT™　Fluorescent Oligo)(目录号　2013)帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件，在每一次实验都包括BLOCK-iT™荧光寡聚物，作为转染效率的指示剂。如果需要的更多的信息，请参阅BLOCK-iT™荧光寡聚物说明书，说明书可以通过我们的网站下载或者通过拨打技术服务热线。

需要材料

开始实验前准备下列试剂：
·目的哺乳动物细胞系（使用传代数低的细胞；转染前确信细胞健康和超过90％的存活率）
·目的Stealth™ RNA或者siRNA寡聚物（20μM溶解在退火缓冲液中）
·Lipofectamine™ 2000试剂（使用前贮存在+4℃）
·Opti-MEM® I 低血清培养基（使用前37℃预热）
·合适的组织培养板及其它

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