试验程序
1.将DIG标记的对照RNA先稀释成20ng/μl（5μl对照RNA加入20μl DEPC-H2O），取5支Eppendorf管以A、B、C、D、E、F顺序编号，将对照按下列比例稀释成一系列浓度：
编号 对照RNA稀释方法 终浓度
A 20ng/μl RNA 2μl＋RNA稀释缓冲液38μl 1ng/μl
B A 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 100pg/μl
C B 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 10pg/μl
D C 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 1pg/μl
E D 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 0.1pg/μl
F E 5μl＋RNA稀释缓冲液45μl 0.01 pg/μl
* 稀释后的A－E可以在-70℃下至少贮存一年。
2.按照同样的方法将待测的DIG－RNA也稀释成一系列浓度，编号用1、2、3、4、5、6以便于与对照区别。
3.取一片尼龙膜，按照前述方法一的方法点样，第一排点对照，第二排点待测样，不必从浓度A开始，只需点C－F浓度进行检测。
4.用UV交联方法或尼龙膜也可采用120℃烘膜30min.的方法使RNA固定于膜上，再用洗膜缓冲液洗膜几秒种。
5.将膜置于封闭液中，室温下封闭30min.。
6.准备抗体溶液：用封闭液按1∶5000的比例稀释Anti-DIG-AP。
7.将膜置于抗体溶液中，室温下保持30min.，注意抗体溶液必须没过膜。
8.室温下用洗膜缓冲液洗膜2次，每次15min.。
9.再将膜置于检测缓冲液中2min.。
10.在10ml检测缓冲液中加入45μl NBT和35μl BCIP配制成显色底物溶液（现配现用）。
11.除去检测缓冲液，加入显色底物溶液，在黑暗下显色大约16小时（一般几分钟即可见开始显色），注意在显色过程中，切勿振荡样品盘。
12.当颜色沉淀充分后，停止显色反应，用TE缓冲液或无菌水洗膜5min.。
13.比较对照和样品的颜色测算浓度。
六、Northern 印迹杂交
A. 探针准备
DIG标记的RNA探针与DNA探针相比，显示较强的杂交信号和较地的非特异性背景，因此，只要可能选用RNA探针可以比DNA探针获得更好的杂交结果。如果必须使用DNA探针，建议使用高SDS杂交缓冲液或DIG Easy Hyb以减少背景。
在正式杂交试验之前，优化杂交探针浓度是避免颜色背景所必须的。探针浓度的确定可通过模拟杂交进行。取一小片空白膜，将其浸入不同探针浓度的溶液中（如：1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …），可观察到背景颜色的浓度即可作为杂交探针浓度。在采用荧光检测或采用CSPD化学发光检测时，建议试验探针浓度50－100ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，在此探针浓度下会产生很高的背景，因此，要适当降低探针浓度。
B. 印迹条件
对于1%的变性琼脂糖胶向尼龙膜上印迹转膜，在10×和20×的SSC盐浓度下可以获得相同的结果，转膜时间是在4℃或室温下过夜。
