试验程序（带手套操作）
1.在一经DMPC处理并高压灭菌的无Rnase污染的微型离心管中依次加入下列反应物（离心管置于冰上）：线性化模板DNA 4μl(1μg)
10×NTP标记混合物 2μl
10×转录缓冲液 2μl
DMPC－H₂O 10μl
T3或T7 RNA聚合酶 2μl
2.轻轻混匀反应物，37℃保温反应至少2小时。
3.如果必要，向反应体系中加入2μl无Rnase污染的DnaseI，37℃下再保温反应15min.以除去残留的DNA模板（由于DIG标记的RNA转录量大大超过DNA模板量，因此，这一步有时也可以省略）。
4.向反应体系中加入2μl 200mmol/L的EDTA终止转录反应。
5.再向反应体系加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl冰冷100%乙醇，4℃下沉淀过夜
6.4℃下，12000rpm离心15min.，沉淀用70%冷乙醇洗涤一次，真空干燥。
7.沉淀按1μg/10μl的浓度重悬于DEPC-H₂O中（每一反应体系约10μg），并向其中加入20unit Rnase抑制剂，置于-20℃保存备测，检测后按一次杂交使用的体积分装再置于-70℃下保存。
DIG标记的RNA在-70℃条件下可以稳定地保存至少1年。
B. DIG标记有效性检测

RNA转录物能通过琼脂糖变性胶电泳检测其探针完整性。标记效果可通过抗DIG碱性磷酸酶直接检测，有两种方法可以选择。

方法一、用标准DIG测试条比较鉴定

使用测试条鉴定包括两个步骤：首先，将转录标记的RNA稀释成一系列的浓度，并点样到空白测试条上（对照测试条已用一系列浓度点样）；其次，将点样的备测试条与对照测试条一起进行免疫、显色反应，然后根据对照测试条计算备测样品的浓度。

试剂及其配制
20×SSC：3mol/ NaCl(175g/L)
0.3mol/L 柠檬酸三钠•2H₂O(88g/L)
pH 7.0
RNA稀释缓冲液：DMPC-H₂O/20×SSC/甲醛(5:3:2)
Anti-DIG-AP
NBT溶液：75mg/ml NBT溶解在DMF（二甲基甲酰胺）中
BCIP溶液：50mg/ml BCIP溶解在DMF中
DIG空白试剂条：带正电荷的尼龙膜
对照试剂条：在相同膜上已用不同浓度的DIG标记DNA点样（300,100,30,10,3pg）
洗膜缓冲液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
0.3%(v/v) Tween20
pH 7.5
Maleic acid缓冲液：100mmol Maleic acid
150mmol NaCl
pH 7.5
封闭液：5% (w/v) SDS
17mmol/L Na₂HPO₄
8mmol/L NaH₂PO₄
室温保存，如果需要，用0.45μm的滤膜过滤除菌。
检测缓冲液：100mmol Tris-HCl(pH 9.5)
100mmol NaCl
TE缓冲液：10mmol Tris-Cl (pH 8.0)
1mmol EDTA

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