试剂及其制备
T4 DNA连接酶
连接缓冲液（可直接购买或配制），10X 缓冲液配方为：
0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.8
0.1 mol/L MgCl₂
50mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）
ATP 5mmol/L ( 如果直接购买商品缓冲液，有的已加在缓冲液中，但有些需单独加入)。
BSA 0.25mg/L
PEG (3500~8000均可，在缓冲液中加入2%~3% 的PEG可提高平端连接效率)。
无菌蒸馏水（SDW）

试验程序
1. 建立以下反应体系（终体积20μl）：
4μl 质粒 ( 50μg/μl)
6μl 目的DNA ( 100μg/μl)
2μl 10X 连接缓冲液
2μl DNA 连接酶
6μl 无菌蒸馏水
2. 反应管置于15℃条件下保温反应24小时，65℃加热10min.终止反应。
3.取5～10μl连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果，其余反应物于-20℃保存备用。

注意事项
1.保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在3∶1，因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接，低浓度的DNA则会增加载体自连。
2.DNA连接酶对温度敏感，在15℃以上会迅速失活，因此，连接反应的温度控制必须严格。
3.为了保证RNA探针的质量，模板DNA片断的完整性和纯度十分重要，在DNA制备时要严格控制。

C.感受态细胞制备（CaCl₂>法）

试剂及其配制
LB培养基（200ml）：2g胰蛋白冻、1g酵母浸膏、2g NaCl，溶解后调整pH至7～8，定溶到200ml混匀，分装成50ml/瓶后灭菌4℃保存。
CaCl₂ 0.1mol/L，4℃保存。
E. coli菌株：JM105或TG1。

试验程序
1.将单菌落菌株接种于5ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养过夜。
2.取0.5ml过夜培养的菌液接种于50ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养约3小时，用分光光度计检测OD₆₀₀＝0.3～0.4时，取出培养瓶置于冰上完全冷却。
3.将菌液转入离心管中，在4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。
4.将沉淀悬浮于预冷的25ml 0.1mol CaCl₂>中，在冰上放置30min.后，于4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。
5.沉淀重悬于2ml 预冷0.1mol CaCl₂溶液中，菌液直接用于转化。或加入1.6ml 80%甘油，按每管200μl分装于2ml的冻存管中，于液氮中速冻后-70℃保存备用。

D. 质粒DNA转化

试剂及其配制
LB培养基（同C）。
氨苄青霉素：用无菌蒸馏水配制成50mg/ml的贮存液。
含氨苄青霉素（AP）的LB平板：每升LB培养基中加入15g琼脂，溶化后高压灭菌，待稍凉后再加入氨苄青霉素至终浓度为50~100μg/ml。在超净工作台上用9cm灭菌培养皿铺板。
IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：取2g溶于8ml双蒸水中，定容至10ml，过滤灭菌后-20℃保存。
X – Gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)：贮存液浓度为20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20℃黑暗保存。

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