1.1沉默效率高、强度大的载体的构建
Waterhouse 等[3]发现在强结构型启动子下游插入反向重复片段的重组双元载体是诱导RNA沉默的最基本结构。在该载体中，目标基因的cDNA 片段被克隆在间隔序列的两端，这些片段通过头头相连或尾尾相连导致该转基因产生自我互补的hpRNA (分子内dsRNA)结构。Wesley 等[5]证实用反义抑制和共抑制等传统方法介导的PTGS 的沉默效率在 0%~30%，平均为12%~13%，而hpRNA 结构则能显著提高RNA 沉默的效率和强度。如空间序列是 cDNA 片段或不能被剪切掉的内含子，其沉默效率在48%~69%，平均为58%，若将有功能的内含子 (转录后能被剪切掉)替代该空间序列则可进一步将沉默的效率提高至66%~100%，平均为90%。事实上，利用hpRNA结构进行植物抗病毒和沉默内源基因已有许多成功的报道。如牛颜冰等(待发表)将番茄花叶病毒的移动蛋白基因(ToMV-MP)的反向重复结构转化烟草，在所得的47株转基因烟草中就有23 株对ToMV 有免疫作用；将黄瓜花叶病毒的部分复制酶基因(CMV-ΔRep)的反向重复结构转化烟草，在所得的40 株转基因烟草中就有25 株对CMV具有免疫作用。
Kamath 等[6]认为在全基因序列或表达序列标签等的协助下，利用hpRNA 结构诱导RNA 沉默是一种十分有效地研究植物基因功能的手段。但由于必须将两个同源的DNA片段以相反的方向克隆进同一载体才能形成hpRNA 结构，致使构建hpRNA 结构的劳动量很大，加之大的双元载体也限制了克隆 DNA 片段的酶切位点的利用，造成其转化效率低下，故hpRNA 结构不适合大量分析基因的功能。
1.2高产量RNA沉默载体的构建
以重组为基本克隆方法的Gateway 技术不需要限制性酶切和连接的烦琐步骤，在Gateway 双元载体pHELLSGATE中，cDNA片段能以反向重复的方式一步克隆在内含子两端。它克服了hpRNA结构构建的种种缺陷，借助于Gateway 介导的策略，研究者正在构建大约含有25 000 个特定基因标签的高产量的RNA沉默载体。这一资源与接近饱和的插入突变体库的联合应用将能极大地促进基因功能的鉴定。
1.3RNA沉默目标特定性载体的构建
除Gateway 技术外，以RdRP 介导的、siRNA 扩增为基础的、借助于异源3' 端非翻译区的沉默系统（SHUTR），也适用于许多基因的功能分析。在SHUTR 方法中，硝酸还原酶（NOS）的3' 端非翻译区反向重复排列用以产生初级siRNAs，5' 端单链区产生次级siRNAs来决定目标的特定性，这一过程称为转移RNA沉默。在基因功能研究方面，转移RNA沉默的优势是善于寻找几个具有重叠功能的相关成员，不太适合于高度保守的基因家族的某一特定基因的功能研究。事实上，Palatnik 等[7]已用拟南芥JAW的miRNA沉默了多TCP基因的mRNAs。至于目标的特定性，Mette 等[8]认为，相对于转录区而言，某一基因家族高度类似的成员的启动子区没有必要非有保守序列。
1.4特定植物RNA沉默载体的构建
随着研究者试图对特定基因进行深入研究，以组织特异性行为沉默基因表达愿望的加强，RNA沉默载体的构建方法也得到了进一步发展。例如， Guo 等[9]为了控制RNA 沉默起始的时间，利用17β 系统和Cre/loxP 介导的重组系统，构建了适用于必需基因或在植物的不同发育阶段起多重作用基因功能分析的特定的载体系统。最近Roignant 等[10]发现果蝇的某些细胞中没有发生系统性沉默，存在着特定细胞的RNAi。随后Palauqui 等[11]又证实，由于 RNA沉默信号的系统传导特性，植物局部的或限时的RNA 沉默系统还没有变为现实。不过有趣的是，有些病毒蛋白能抑制系统沉默，但不抑制局部沉默。另外，有研究表明控制拟南芥叶片极性的基因 PHV，在体外miR165 的指导下，能被Dicer 切割，认为PHV 能依赖于miR165 RNA发生局部沉默。对 RNA沉默的系统特性和miRNA介导的基因表达的发育控制的阐明，将有助于RNA沉默系统更加复杂化和多样化。
1.5新型的DNA卫星分子——DNA βRNA沉默载体的构建
VIGS研究基因功能的方法是将携带植物功能基因cDNA 的病毒侵染植物，通过诱导植物发生基因沉默而使植物出现表型突变，从而借助于植物表型或生理指标的变化来反映基因的功能。以往多是以 RNA 病毒、DNA 病毒以及极少的卫星病毒载体的 VIGS 体系来研究基因的功能，最近Tao 和Zhou[12] 建立了一种以新型的DNA 卫星分子为载体的VIGS 体系。
