2．pBlueScriptII的双酶切消化
1．以如下体系进行EcoRI酶切：
pBSK(+)                   X µl（6µg）
ddH₂O                     174-X µl 
10×Buffer E                20 µl
混匀，加入限制性内切酶：
EcoRI （10U/ µl）            6 µl   
总体积为200 µl。
2．轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。
3．37℃，水浴1hr。
4．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。4℃，13000rpm，离心15min。
5．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。
6．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。
7. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。
8．加入200ul 70％的乙醇洗沉淀。
9．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。
10．自然风干沉淀，至无乙醇味，加入100ul ddH2O充分溶解沉淀。
11．加入以下试剂进行XhoI酶切：
  ddH₂O                   74 µl 
10×Buffer D               20 µl
混匀，加入限制性内切酶XhoI：
            XhoI （10U/ µl）         6 µl   
总体积为200 µl。
12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下
13.37℃，水浴1.5hr。
14．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。
15．4℃，13000rpm，离心15min。
16．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。
17．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。
18. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。
19．加入200ul 70％的乙醇洗沉淀。
20．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。
21．自然风干沉淀至无乙醇味，加入40ulddH2O充分溶解沉淀，得到双酶切载体。
3．载体去磷酸化
1．在40ul双酶切载体中加入以下试剂：
              6ul   10×buffer
              6ul     CIAP（0.01U/ul）
              8ul    ddH₂O
   总体积60ul。
2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。
3.37℃，水浴1hr。
4．70℃，15min，灭活酶。
5．电泳分离，胶回收双酶切载体，定量。
4．载体效率检测
1．按以下所示作4个连接反应：

	DNA	连接酶
1	pBlueScriptII/E/X /CIAP	-	检测酶切效率
2	pBlueScriptII/E/X /CIAP	+	检测脱磷效率，载体自连效率
3	商品Vector加标准Insert	+	对照
4	自制Vector加标准Insert	+	检测载体效率

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