▲变性电泳胶：
称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。
▲变性电泳缓冲液：
在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml
(二)动物组织totalRNA的提取
1．根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。
2．将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。
3．根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。
4．根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。
5．冰浴10分钟。
6．4℃，12000g离心20分钟。
7．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。
8．加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀30分钟以上。
9．4℃，12000g离心20分钟。
10．根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。
11．加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。
12．4℃，12000g离心20分钟。
13．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀至少30分钟。
14．4℃，12000g离心20分钟。
15．弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4℃，12000g离心10分钟。
16．弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。
17．取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。
表1
|
Mg# of tissue |
500 |
800 |
1000 |
|
变性裂解液(ml) |
5 |
8 |
10 |
|
2M NaOAC pH 4 (ml) |
0.5 |
0.8 |
1 |
|
水饱和酚 (mL) |
5 |
8 |
10 |
|
氯仿 (mL) |
1 |
1.6 |
2 |
|
异丙醇(mL) |
4 |
6 |
8 |
|
变性裂解液 (mL) |
0.5 |
0.8 |
1 |
|
异丙醇(mL) |
0.5 |
0.8 |
1 |
|
75% 乙醇(mL) |
1 |
1 |
1 |
|
DEPC-treated H20 (mL) |
0.5 |
0.8 |
1 |
(三)植物组织totalRNA的提取
1.先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。
2.将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入3ml变性裂解液）。
3.加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。
4.加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。
5.冰浴10min。4℃，12000g离心10min
6.小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。
7.4℃，12000g离心20min。
